（2）幾何異構(gòu)體的鑒定

在理論上，β-胡蘿卜素幾何異構(gòu)體的鑒定也可以在其雙向核磁共振譜(NMR)上實(shí)現(xiàn)。但目前沒(méi)有文獻(xiàn)報(bào)道。

β-胡蘿卜素異構(gòu)體的電子吸收光譜特不同。順式異構(gòu)體的主吸收峰與反式異構(gòu)體的主吸收峰相比，其電子吸收光譜發(fā)生“紫移”。同時(shí)，順式異構(gòu)體在342～348nm處會(huì)出現(xiàn)一個(gè)特征吸收峰。這些光譜特征可作為判斷β-胡蘿卜素異構(gòu)體的重要依據(jù)。

如上所述，由于分子在一個(gè)雙鍵處發(fā)生了順式異構(gòu)，在β-胡蘿卜素的電子吸收光譜上342～348nm處會(huì)出現(xiàn)一個(gè)峰(吸收段)。這個(gè)峰被稱為“順式峰”(cis-peak)。分子中發(fā)生順式異構(gòu)的部分被稱為“cis-band”。同時(shí)，與全反式異構(gòu)體比較，順式異構(gòu)體主吸收峰的最大吸收波長(zhǎng)(λmax)也會(huì)發(fā)生輕度的“紫移”。圖3中的I、Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ號(hào)峰的電子吸收光譜圖在λmax=342～347nm左右與全反式異構(gòu)體的光譜比較可以看到有明顯的峰存在，詳見(jiàn)圖2；圖3為順式峰的相對(duì)高度；同時(shí)，與Ⅳ號(hào)峰的光譜比較，I、Ⅱ、Ⅲ號(hào)峰光譜主吸收峰和順式吸收峰的λmax；分別發(fā)生了5～6nm和1～4nm的“紫移”，見(jiàn)圖4。這些光譜特征的變化提供了將I、Ⅱ、Ⅲ號(hào)峰鑒定為β-胡蘿l、素順式異構(gòu)體的證據(jù)。

（3）幾何異構(gòu)體的定量測(cè)定

在C30-HPLC上，β-胡蘿卜素的幾何異構(gòu)體可以獲得良好的分離。由于參比樣品的匱乏，β-胡蘿卜素順式異構(gòu)體的定量需基于其電子吸收光譜范圍內(nèi)的吸光系數(shù)。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)的使用可以實(shí)現(xiàn)這個(gè)目的。在ELSD上收集β-胡蘿卜素全反式異構(gòu)體信號(hào)的條件已由惠伯棣等人建立完成。使用LC-PDA-ELSD串聯(lián)系統(tǒng)，同步收集每個(gè)β-胡蘿卜素幾何異構(gòu)體組分的電子吸收光譜和質(zhì)量信號(hào)，由二者峰面積之比推算每個(gè)組分的吸光系數(shù)，最終實(shí)現(xiàn)在C30-HPLC-PDA系統(tǒng)上β-胡蘿卜素各幾何異構(gòu)體的定量檢測(cè)。最終根據(jù)其色譜峰面積，可以準(zhǔn)確測(cè)量出β-胡蘿卜素幾何異構(gòu)體的組成。

一般情況下，用于定量分析的吸光系數(shù)是指在該化合物在λmax處的吸光系數(shù)。β-胡蘿卜素全反式異構(gòu)體于450nm處的吸光系數(shù)已被報(bào)道，如A^1%_1cm。一般在2500左右。

毫無(wú)疑問(wèn)，在PDA檢測(cè)器上，一種β-胡蘿卜素順式異構(gòu)體的量與其在檢測(cè)波長(zhǎng)處的色譜峰面積呈正線性相關(guān)關(guān)系，符合朗伯-比爾定律。如果在ELSD檢測(cè)器上，這種順式異構(gòu)體的量與其峰面積間亦存在正線性相關(guān)關(guān)系，則可回歸其在PDA和ELSD上峰面積之間的線性相關(guān)關(guān)系，并計(jì)算其斜率。最終，按下列方法估算這種順式異構(gòu)體的吸光系數(shù)。

A_Z=A_E（K_Z/K_E)

其中：

A_Z=順式異構(gòu)體吸光系數(shù)；

A_E=全反式異構(gòu)體吸光系數(shù)；

K_Z=順式異構(gòu)體斜率=PDA峰面積／ELSD峰面積；

K_E=全反式異構(gòu)體斜率=PDA峰面積／ELSD峰面積；

根據(jù)朗伯-比爾定律，按下列公式計(jì)算β-胡蘿卜素異構(gòu)體的含量。

x=(A×y)／(A^1％_1cm×100000)

其中：

X=樣品中所含的b，β-胡蘿卜素異構(gòu)體的量(克)；

Y=樣品溶液的體積(毫升)；

A=樣品中各組分的峰面積(毫伏·秒)，A^1％_1cm=吸光系數(shù)，為在1厘米光程長(zhǎng)的比色杯中1％(w／v)濃度溶質(zhì)的理論吸收值，計(jì)算β-胡蘿卜素全反式異構(gòu)體含量時(shí)采用值為ε=2500(450nm)。

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