2.6協(xié)作驗(yàn)證結(jié)果

EAEC標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)通過3家協(xié)作驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)定，測(cè)定結(jié)果如表7所示，EAEC菌體標(biāo)準(zhǔn)樣品菌含量均為103CFU/樣品，與研制的目標(biāo)值一致。生化和特征基因PCR鑒定結(jié)果符合EAEC的特征。同時(shí)EAECgDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特征基因PCR鑒定結(jié)果也符合實(shí)驗(yàn)要求。

2.7標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)使用效果驗(yàn)證

選擇熟肉制品、乳粉、腐乳、餅干和薯片5種食品基質(zhì)共20份樣品對(duì)EAEC標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的使用效果進(jìn)行驗(yàn)證，檢驗(yàn)結(jié)果顯示，20件樣品正常檢驗(yàn)（作為本底對(duì)照）分離平板上未見可疑菌落，而加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的樣品在分離平板上均有可疑菌落生長(zhǎng)，并通過PCR檢測(cè)擴(kuò)增得到相應(yīng)的特征基因條帶，與gDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)擴(kuò)增條帶大小一致。結(jié)果表明，研制的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和基因組標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)適用于食品中腸道集聚性大腸埃希氏菌檢驗(yàn)的質(zhì)控需求。

3討論和結(jié)論

準(zhǔn)確快速的檢測(cè)技術(shù)是及時(shí)有效控制和預(yù)防由病原菌引起的食源性疾病的重要手段。目前食品和腹瀉病人中致瀉大腸埃希氏菌的檢測(cè)越來(lái)越受到關(guān)注和重視。由于致瀉大腸埃希氏菌種類繁多的血清群/型，給檢驗(yàn)工作帶來(lái)很多挑戰(zhàn)。快速準(zhǔn)確的檢驗(yàn)工作不僅依賴于不同技術(shù)的檢驗(yàn)方法，還需要科學(xué)使用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)來(lái)保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。目前，國(guó)內(nèi)針對(duì)微生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制已有較大的發(fā)展，標(biāo)準(zhǔn)菌株多來(lái)自美國(guó)菌種保藏中心（ATCC），而且對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)菌株的鑒定方式多為傳統(tǒng)的生化反應(yīng)。目前對(duì)于具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)而且具有清晰全基因組序列信息的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究還是空白。本研究采用的EAEC標(biāo)準(zhǔn)菌株來(lái)源于中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心（CMCC），分離自我國(guó)腹瀉病人，具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)。

全基因組測(cè)序技術(shù)在微生物領(lǐng)域研究中發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。隨著測(cè)序技術(shù)所獲得數(shù)據(jù)量的突破性進(jìn)展，測(cè)序速度和費(fèi)用得到大幅度改觀。而且二代測(cè)序數(shù)據(jù)分析軟件的日趨完善，非生物信息學(xué)專業(yè)人員可以使用網(wǎng)頁(yè)類型分析工具對(duì)微生物基因組測(cè)序數(shù)據(jù)完成微生物遺傳特征、溯源等信息分析。RapidAnnotationusingSubsystemTechnology(RAST，http://rast.nmpdr.org)能夠快速注釋基因組信息、CenterforGenomicEpidemiology(CGE，https://cge.cbs.dtu.dk/)網(wǎng)站擁有方便快捷的獨(dú)立數(shù)據(jù)分析工具，可以進(jìn)行種屬鑒定、耐藥基因、毒力因子、質(zhì)粒分型以及菌株分子分型等特征分析。這些網(wǎng)頁(yè)類型分析工具可提供更為直觀的用戶界面和簡(jiǎn)便的操作環(huán)境。本研究利用RAST、PATRIC、CGE對(duì)EAEC進(jìn)行了種屬鑒定、血清分型和除astA、aggR、pic特征基因之外的毒力基因分析，為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制奠定了科學(xué)準(zhǔn)確的基礎(chǔ)。

本研究根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB4789.6中的引物序列對(duì)EAEC標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行了特征性基因擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，astA、aggR和pic基因得到清晰的擴(kuò)增條帶，說明PCR擴(kuò)增結(jié)果和全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)結(jié)果準(zhǔn)確對(duì)應(yīng)。在傳統(tǒng)的生化方法基礎(chǔ)上，利用PCR技術(shù)對(duì)毒力基因進(jìn)行擴(kuò)增，是提高EAEC檢出率的有力手段，同時(shí)也為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的檢驗(yàn)提供了快速準(zhǔn)確的方法。

目前研究中報(bào)道的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)包括DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是以粉末形式凍干，本研究制備的EAEC菌體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和gDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均以小球的形式進(jìn)行凍干，相比較粉末形式凍干，該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)使用避免了由于粉末開蓋帶來(lái)的污染和質(zhì)粒污染，并且省去離心步驟，操作更加方便，同時(shí)該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)易于溶解，計(jì)數(shù)更準(zhǔn)確。

本研究制備的EAEC菌體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性良好，經(jīng)單因素方差分析符合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的要求。經(jīng)過25℃、37℃運(yùn)輸穩(wěn)定性測(cè)試，7天仍能保持樣品中菌含量在103CFU/樣品水平，可以保證樣品在非極端的高溫天氣下運(yùn)輸不受影響，而且在-20℃條件下可以長(zhǎng)期儲(chǔ)存。對(duì)于EAECgDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，同樣具有很好的穩(wěn)定性?？紤]到食品基質(zhì)的復(fù)雜性，本研究選用5種不同的食品基質(zhì)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果顯示加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的樣品均能檢測(cè)到EAEC，說明研制的菌體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和gDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)適用于食品中EAEC的檢驗(yàn)，滿足質(zhì)控要求。

綜上所述，EAEC是造成人體中重度腹瀉的重要病原菌之一，開展食品中EAEC檢測(cè)工作對(duì)維護(hù)人類健康意義重大。本研究研制的具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)和全基因組數(shù)據(jù)的EAEC菌體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和gDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性和穩(wěn)定性良好，為EAEC的檢驗(yàn)工作提供了有效參考，保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，有利于保證食品質(zhì)量與安全。該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可用于實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制及實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)，保證我國(guó)食品安全質(zhì)量檢測(cè)數(shù)據(jù)的可靠、可與國(guó)際互認(rèn)。

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