2.9 免疫組織化學檢測:

組織芯片經脫蠟水化、滅活內源性過氧化氫酶、熱抗原修復和BSA封閉后，Copine-3抗體1∶500稀釋后滴加于芯片，4℃孵育過夜。按GTVisionⅢ型免疫組織化學檢測試劑盒說明操作，滴加HRP標記的聚合物(抗兔/鼠)室溫孵育40 min,DAB顯色2 min，蘇木素復染5 min，自來水沖洗10 min返藍，鹽酸乙醇分化10 s，脫水透明后封片光學顯微鏡下檢查。

結果

1．細胞總RNA提取及CPNE3基因擴增

如圖1所示，使用總RNA提取試劑盒提取HBE的總RNA，經1%瓊脂糖凝膠電泳，結果顯示，3條RNA條帶較為清晰、完整，沒有明顯彌散、降解現(xiàn)象，表明提取的RNA質量較好。

使用隨機引物將總RNA反轉錄為c DNA。以c DNA為模板，利用合成的CPNE3基因特異性引物進行PCR擴增。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn)與預期分子量大小相同的條帶(約1600 bp)。

2．重組質粒p EGFP-N1-CPNE3的構建及鑒定

重組質粒p EGFP-N1-CPNE3經XhoⅠ和Bam HⅠ雙酶切后，經1%瓊脂糖凝膠電泳后，其中1條片段(約1600 bp)與目的基因大小一致，另1條片段(約5000 bp)與p EGFP-N1質粒雙酶切后大小一致(圖2)。

對重組質粒進行DNA測序，結果經生物大分子序列比對搜索工具(basic local alignment search tool,BLAST)比對，插入片段與目的基因序列一致。表明成功構建了重組質粒p EGFP-N1-CPNE3。

3．熒光倒置顯微鏡觀察

轉染細胞48 h后，于熒光倒置顯微鏡下觀察，分別轉染p EGFP-N1質粒的對照組和p EGFP-N1-CPNE3重組質粒的實驗組細胞均有綠色熒光。表明質粒轉染細胞成功并表達EGFP(圖3)。

4．激光掃描共焦顯微鏡觀察

p EGFP-N1質粒轉染的293T和H1299細胞中，EGFP在細胞內表達分布均勻;重組質粒p EGFP-N1-CPNE3轉染的細胞，在激光掃描共焦顯微鏡下可以觀察到，綠色的Copine-3-EGFP與紅色的GAPDH，以及藍色的DAPI均有重合，表明Copine-3-EGFP融合蛋白定位于細胞質和細胞核(圖4)。

5．光學顯微鏡觀察

分別收集正常培養(yǎng)的293T和H1299細胞，按步驟2.7操作，在加入抽提試劑B處理前后分別取樣經結晶紫染色后光學顯微鏡下觀察。加入抽提試劑B前，細胞結構完整，可觀察到完整的細胞;加入抽提試劑B后，細胞膜在低滲透壓條件下膨脹破裂，完整的細胞核被分離出來(圖5)。表明該方法適用于胞質蛋白和胞核蛋白的分離。

6. Western blotting檢測Copine-3蛋白表達

分別提取轉染p EGFP-N1-CPNE3重組質粒的293T和H1299細胞的胞質蛋白和細胞核胞核蛋白，進行Western blotting檢測。骨架蛋白β-actin和組蛋白Histon H1分別在胞質蛋白和胞核蛋白中被檢測到;在胞質蛋白和胞核蛋白中均檢測到Copine-3蛋白。表明Copine-3蛋白在細胞質和細胞核中均有表達(圖6)。

7．免疫組織化學觀察

對肺腺癌組織臨床樣品進行免疫組織化學檢測，結果如圖7，箭頭所示，細胞質和細胞核中均有棕色顯色，Copine-3蛋白定位于細胞質和細胞核。

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