紫山藥抗性淀粉調(diào)節(jié)高脂血癥金黃地鼠脂質(zhì)代謝（一）

發(fā)布時(shí)間：2021-06-15 10:27 編輯者：特邀作者周世紅

高脂飲食可導(dǎo)致血脂升高，嚴(yán)重時(shí)可引起一些危害人體健康的疾病，如動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病和胰腺炎等，已成為現(xiàn)代社會(huì)人群主要的營養(yǎng)問題之一。此外，長期食用高脂膳食還可導(dǎo)致體脂異常積累和腸道微生物群的不平衡。通過飲食干預(yù)預(yù)防由高脂飲食引起的健康問題正成為研究的熱點(diǎn)。

抗性淀粉在小腸中難以被酶解吸收，而在大腸中可被酵解，其通過上消化道進(jìn)入大腸，經(jīng)細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)生短鏈脂肪酸，調(diào)節(jié)腸道菌群，降低血糖和膽固醇，抑制脂肪的吸收積累，改善慢性炎癥。盲腸是大腸的起始段，雖然盲腸、結(jié)腸是細(xì)菌最密集和多樣的區(qū)域，且二者內(nèi)容物中菌群結(jié)構(gòu)具有相似性，但是優(yōu)勢(shì)菌群存在差異。目前關(guān)于盲腸中菌群變化特征與改善因高脂飲食誘導(dǎo)高血脂和高血糖關(guān)系的研究少有報(bào)道。紫山藥（PurpleDioscoreaalataL）為多年生藤本植物薯蕷（DioscoreaalataL）的塊莖，在我國南方地區(qū)廣泛種植，淀粉約占生物總量的16%～20%。

本研究以紫山藥高抗性淀粉為原料，揭示紫山藥高抗性淀粉對(duì)盲腸微生物的益生作用及其改善高血脂癥效能，可為盲腸菌群及脂質(zhì)代謝與健康的研究提供依據(jù)。

1材料和設(shè)備

1.1材料與試劑

紫山藥（紫玉淮山），產(chǎn)自福建省三明市建寧縣。普魯蘭酶（2800U/g）、高溫α-淀粉酶（8000U/mL），美國Sigma公司；淀粉葡糖苷酶（100000U/mL），上海麥克林生化科技有限公司；D-葡萄糖檢測(cè)試劑盒，愛爾蘭Megazyme公司；血脂試劑盒，南京建成生物工程研究所；ＴIANampStoolDNAkit試劑盒，天根生化科技有限公司；檸檬酸、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、無水乙醇均為國產(chǎn)分析純?；A(chǔ)飼料成分：碳水化合物72.3%、蛋白質(zhì)14.9%、脂肪12.8%；高脂飼料成分：氫化椰子油5%，玉米油5%，膽固醇0.2%和基礎(chǔ)飼料89.8%。飼料購自南通特洛菲飼料科技有限公司。

1.2主要設(shè)備與儀器

DHG-9003A型熱風(fēng)干燥箱，上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司；SYQ-DSX-280B型高壓滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；ＴDL-5-A型低速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；ＶERＴEX70型傅里葉紅外光譜儀，德國布魯克分析儀器公司；GA-3型血糖儀，三諾生物傳感股份有限公司；CFX96型熒光定量PCR儀，美國Bio-Rad公司；PE300型IlluminaMiSeq測(cè)序儀，美國Illumina公司。

2試驗(yàn)方法

2.1紫山藥抗性淀粉的制備

紫山藥淀粉的制備見文獻(xiàn)。將50.0g紫山藥淀粉（干基），加至200mL磷酸緩沖溶液（0.2mol/L，pH5.0）中煮沸30min，降溫至58℃；加入普魯蘭酶（2800U/g）攪拌12h；調(diào)節(jié)至7.0，120℃保溫30min，冷卻至4℃貯藏24h，反復(fù)2次；將沉淀粉40℃干燥后，稱取20.0g加入100mLpH6.0乙酸鈉緩沖溶液，升溫至90℃，加入0.3mL高溫α-淀粉酶（8000U/mL）保持1h，冷卻至60℃并用稀釋的檸檬酸調(diào)節(jié)pH至4.5，加入0.3mL淀粉葡糖苷酶（100000U/mL）保持1h；以3000×g離心15min，蒸餾水洗滌淀粉3次，體積分?jǐn)?shù)95%乙醇洗滌3次，40℃干燥24h，粉碎過100目篩，得高抗性淀粉（HRS）。經(jīng)檢測(cè)，HRS中的快速消化淀粉、緩慢消化淀粉和抗性淀粉的含量分別為11.4%，28.4%和60.2%。

2.2 FTlR分析

傅里葉變換紅外光譜（FＴIR）分析根據(jù)Wang等的方法稍做修改。將干燥的HRS樣品與溴化鉀以1∶100～1∶150的比例進(jìn)行混合，充分研磨。將研磨好的粉末倒入模具中抽真空壓片，12MPa的壓力下保持30s，壓至透明，在4000～400cm^-1掃描范圍內(nèi)利用傅里葉變換紅外光譜掃描儀觀察。

2.3動(dòng)物模型建立

雄性金黃地鼠，SPF級(jí)，6～8周齡，體重90～110g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將32只金黃地鼠隨機(jī)分為4組飼喂：正常對(duì)照組（NC）：基礎(chǔ)飼料+等量生理鹽水；模型組（MC）：高脂飼料+等量生理鹽水；HRS低劑量組（LR）：高脂飼料+0.5g/100gbw高抗性淀粉；HRS高劑量組（HR）：高脂飼料+1.5g/100gbw高抗性淀粉。金黃地鼠自由采食、飲水，10h/14h白晝交替喂養(yǎng)4周。

2.4盲腸內(nèi)容物收集

在第2和第4個(gè)周末禁食12h，各試驗(yàn)組分別宰殺3只和5只金黃地鼠，收集盲腸內(nèi)容物包裝后于-80℃冷凍。

2.5血清指標(biāo)測(cè)定和臟器變化

在第4周末眼眶取血后處死，快速剝離肝臟、腎臟、脾臟、附睪和腎周的脂肪組織并稱重；將血液收集在采血管中，于4000r/min、4℃離心15min，血清分裝在1.5mL離心管中，于-20℃保存?zhèn)溆?；按照血脂測(cè)定試劑盒說明書測(cè)定甘油三脂（ＴG）、總膽固醇（ＴC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）的濃度。

2.6 DNA提取和16SrDNA基因PCR擴(kuò)增

使用ＴIANampStoolDNAkit試劑盒從金黃地鼠盲腸內(nèi)容物中提取DNA。以盲腸內(nèi)容物中細(xì)菌基因組為模板，以520F和802R為上下游引物，擴(kuò)增16SrDNA的Ｖ4區(qū)。其中，PCR反應(yīng)體系（50μL）：10×Ｔaqbuffer5μL；dNＴP5μL；上游引物515F（20μmol/L）0.5μL；下游引物806R（20μmol/L）0.5μL；Ｔaq酶0.5μL；模板1μL；ddH2O37.5μL。PCR反應(yīng)條件：94℃3min；94℃45s，50℃60s，72℃90s，35個(gè)循環(huán)；72℃10min。

2.7測(cè)序數(shù)據(jù)的生物信息分析

采用Illumina公司的ＴruSeqNanoDNALＴLibraryPrepKit制備測(cè)序文庫，在IlluminaMiseq測(cè)序儀上進(jìn)行測(cè)序；將測(cè)序條帶拼接，按照與參照序列≥97%的相似度聚類，建立OＴU，并確定種系型。利用熱圖和分類組成分析（LEfSe分析）分別研究金黃地鼠盲腸菌群豐度和分類組成的變化。