近年來，除食品中轉(zhuǎn)基因成分的安全性、產(chǎn)品標(biāo)示問題外，食品生產(chǎn)貯藏過程中微生物污染導(dǎo)致的食源性疾病及食品成分摻假等食品安全事件也受到人們?cè)絹碓蕉嗟年P(guān)注，傳統(tǒng)方法難以滿足不斷提高的快速檢測要求，而精準(zhǔn)、快速、靈敏、穩(wěn)定的數(shù)字PCR技術(shù)則為食品相關(guān)檢測提供了新的思路和方法。國內(nèi)外學(xué)者研究了數(shù)字PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)基因植物鑒別定量、肉制品中摻假種類及含景分析、食品致病菌檢測中的應(yīng)用，建立高效可行的檢測方法并填補(bǔ)了相關(guān)檢測標(biāo)準(zhǔn)的空白。本文回顧總結(jié)了數(shù)字PCR技術(shù)在食品轉(zhuǎn)基因成分、食品源性成分、微生物檢測中的應(yīng)用，并對(duì)其存在的問題進(jìn)行了分析。

1數(shù)字PCR概述

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(P01ymnerasechainreaction，PCR)是分子生物學(xué)研究中使用較多的方法，主要有普通PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)、反轉(zhuǎn)錄PCR(RT—PCR)等。其中qPCR是目前常用的定性及定量基兇分析技術(shù)，但該方法需要使用標(biāo)準(zhǔn)品、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并利用循環(huán)閾值對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，小僅增大了工作量和檢測成本，在實(shí)際檢測過程也會(huì)造成一定誤差。

上世紀(jì)90年代Sykes等將PCR技術(shù)、樣品稀釋、泊松分布計(jì)算方法結(jié)合，對(duì)白血病克隆的重排免疫球蛋白重鏈(IgH)基因進(jìn)行定量，這是數(shù)字PCR技術(shù)首次出現(xiàn)在大眾視野。1999年，VogelsLein等稀釋分離單個(gè)分子后分別擴(kuò)增，然后使用熒光探針分析每種產(chǎn)物是否存在突變，檢測結(jié)腸直腸癌患者糞便中突變的ras基因來證明了其可行性，并首次提出了數(shù)字PCR的概念：數(shù)字PCR(DigitalPCR，dPCR)是一種針對(duì)單分子目標(biāo)DNA擴(kuò)增的絕對(duì)定量技術(shù)。

數(shù)字PCR工作原理在于將被標(biāo)記的樣品分割形成大量獨(dú)立的反應(yīng)體系，每個(gè)獨(dú)立反應(yīng)體系中小含或含有一個(gè)及以上待測靶標(biāo)序列，含有待測靶標(biāo)序列的為陽性，不含待測靶標(biāo)序列的為陰性。在每個(gè)獨(dú)立反應(yīng)體系中對(duì)被標(biāo)記的樣品進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)到達(dá)終點(diǎn)后，含有待測基因靶標(biāo)的反應(yīng)體系中可檢測到熒光信號(hào)，不含待測基因靶標(biāo)時(shí)沒有信號(hào)積累，讀取陰性、陽性微滴的數(shù)量后傳至數(shù)據(jù)處理軟件得到最終結(jié)果。與qPCR相比，數(shù)字PCR無需標(biāo)準(zhǔn)品也不借助循環(huán)閾值進(jìn)行分析，一定程度上彌補(bǔ)了qPCR的不足。

2011年后，數(shù)字PCR商業(yè)化迅速發(fā)展，其中兩種類型的數(shù)字PCR儀在研究中使用較多，一種是基于高密度微孔芯片的數(shù)字PCR(ccPCR)，如LifeTechnologies鈷牌的QuanLStudioTM3DDigiLalPCRSystem，每張芯片上含有20000個(gè)微孔，滿足檢測要求。另一種是利用油包水液滴作為載體的數(shù)字PCR(DropletdigitalPCR，ddPCR)，如Raindance公司的Raindrop、Bio-Rad公司的QX200^TM及QX100等，其中Bio-Rad公司的QX200TM是現(xiàn)階段最領(lǐng)先的數(shù)字PCR系統(tǒng)。

數(shù)字PCR在定量分析過程中無需借助標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)也無需依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線，并且準(zhǔn)確度高，靈敏度優(yōu)于傳統(tǒng)方法及qPCR等方法，可達(dá)到qPCR方法的10倍甚至更高；在一定檢測范同內(nèi)，線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)偏差小，準(zhǔn)確度高，且不同實(shí)驗(yàn)室或檢測機(jī)構(gòu)問重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果波動(dòng)小。其作為分子定量檢測中最可靠的方法之一，近年來在拷貝數(shù)定景、微生物檢測、檢驗(yàn)檢疫、醫(yī)學(xué)診斷研究、基因檢測、資源環(huán)境科學(xué)。等領(lǐng)域均有研究，在食品相關(guān)檢測方面也有著巨大潛力。

2食品轉(zhuǎn)基因成分分析

目前全球范圍內(nèi)商業(yè)化轉(zhuǎn)基因食品中，以能夠滿足營養(yǎng)要求且能夠更好適應(yīng)栽培條件的轉(zhuǎn)基因植物及以其為原料生產(chǎn)的產(chǎn)品為主，市售轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的種類與數(shù)量快速增加，其安全性、標(biāo)識(shí)及市場管理問題等都亟需解決。國內(nèi)外現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)轉(zhuǎn)基因作物及相關(guān)產(chǎn)品的檢測主要采用基于外源核酸序列的qPCR技術(shù)，為了更加快速準(zhǔn)確檢測轉(zhuǎn)基因成分，諸多研究者利用數(shù)字PCR技術(shù)對(duì)不同植物轉(zhuǎn)基因成分的檢測方法進(jìn)行研究。

MorisseL等最早建立了利用數(shù)字PCR同時(shí)檢種轉(zhuǎn)基因玉米基因拷貝的絕對(duì)數(shù)量的方法，得測定的靈敏度及檢測范圍明顯優(yōu)于cdPCR及qPCR方法，證實(shí)了數(shù)字PCR在轉(zhuǎn)基因作物檢測中的行性及優(yōu)勢(shì)。朱鵬宇、繆青梅等研究者分別建立雙重ddPCR檢測方法對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻Bt汕優(yōu)63和抗蟲耐除草劑轉(zhuǎn)基兇水稻G6H1進(jìn)行研究，樣品中轉(zhuǎn)成分占總質(zhì)量0．5％時(shí)也可得到精確結(jié)果。

Deng等對(duì)水稻的不同基因進(jìn)行了評(píng)估和對(duì)比，基于SPS、RBE4和ppi-PPF基因建立的ddPCR系統(tǒng)精確可靠，絕對(duì)定量檢測限(LimitofQuantitation，LOQ)為10～20拷貝／反應(yīng)，可以重復(fù)定量并精確地在LOQ之上對(duì)水稻的三個(gè)內(nèi)源基因進(jìn)行定量，含量低至0.1％時(shí)比采用相同探針和引物進(jìn)行檢測的qPCR體系更為準(zhǔn)確。于曉帆等用轉(zhuǎn)基因大豆DAS-44406-6的5’端邊界序列及l(fā)ecin流基因，對(duì)其定量檢測(總DNA模板濃度為50ng／反應(yīng)時(shí))，相對(duì)靈敏度檢測方法能對(duì)轉(zhuǎn)基岡大豆質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的樣品準(zhǔn)確定量；絕對(duì)靈敏度檢測限可達(dá)到模板DNA質(zhì)量濃度0．01ng/μL。此外還可利用特殊外源基因及內(nèi)參基因設(shè)計(jì)引物建立dPCR方法對(duì)油菜、土豆、等轉(zhuǎn)基因作物及油類產(chǎn)品進(jìn)行研究，最低檢測限可達(dá)到5個(gè)拷貝以下，絕對(duì)定量范圍均優(yōu)于qPCR方法。

在對(duì)dPCR方法檢測限、靈敏度的研究基礎(chǔ)上，Wang等將轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1制成的米餅采用烘焙、油炸等不同方法處理后進(jìn)行分析，結(jié)果表明，ddPCR方法比qPCR方法更為靈敏，也不易受到加工過程中所產(chǎn)生的PCR抑制劑的影響，對(duì)深加工產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分的定量更為穩(wěn)定和準(zhǔn)確。Bogozalec等對(duì)不同復(fù)雜基質(zhì)飼料中的轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行檢測，得到的結(jié)果表明數(shù)字PCR技術(shù)可以檢測濃度較高的樣品，而使用qPCR方法則需稀釋180倍。當(dāng)樣品中有較高濃度色素、酸性物質(zhì)、重金屬等物質(zhì)及其他潛在抑制劑時(shí)，數(shù)字PCR方法的檢測結(jié)果更準(zhǔn)確，避免了可能存在的“假陰性”現(xiàn)象，從而對(duì)深加工食品及復(fù)雜基質(zhì)樣品進(jìn)行檢測與定量，對(duì)于轉(zhuǎn)基因作物研究、市場監(jiān)督管理及轉(zhuǎn)基因食品標(biāo)識(shí)規(guī)范化進(jìn)程具有重要價(jià)值。此外，現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)中的已有的qPCR檢測方法中所采用的引物、探針可轉(zhuǎn)移至數(shù)字PCR檢測系統(tǒng)中，具有較好的替代性，并且在cdPCR及ddPCR問的一致性及通用性較好。

日前對(duì)轉(zhuǎn)基因作物成分進(jìn)行鑒定時(shí)，雙重ddPCR及單重ddPCR方法的選擇存在一定爭議，兩種方法的穩(wěn)定性及檢測限均優(yōu)于qPCR，部分研究表明雙重PCR方法的檢測限略高于單重PCR，但其標(biāo)準(zhǔn)偏差較小且可以節(jié)約實(shí)驗(yàn)材料和檢測時(shí)間，因此需要根據(jù)不同檢測靶標(biāo)及引物、探針進(jìn)行對(duì)比選擇。有研究者建立了多重?cái)?shù)字PCR檢測方法，同時(shí)檢測6、7、11個(gè)品系的轉(zhuǎn)基因大豆，能夠節(jié)約大最成本及時(shí)間，為同一物種不同轉(zhuǎn)基因品系的快速檢測提供了新的思路。此外，由于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物產(chǎn)品安全性問題爭議較大，大部分轉(zhuǎn)基因動(dòng)物主要用于藥物生產(chǎn)或作為生物反應(yīng)器，僅2015年美國FDA批準(zhǔn)上市了轉(zhuǎn)基因三文魚，國內(nèi)尚無轉(zhuǎn)基因動(dòng)物批準(zhǔn)上市。有研究者對(duì)轉(zhuǎn)人乳鐵蛋白基因山羊的數(shù)字PCR檢測方法進(jìn)行了研究，證實(shí)了其在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物成分外源基因拷貝數(shù)檢測中的可行性，但在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物為原料的轉(zhuǎn)基因食品中尚無相關(guān)報(bào)道。對(duì)于轉(zhuǎn)基因微生物而言，有研究者利用數(shù)字PCR建立基因拷貝數(shù)與木聚糖酶活力的關(guān)系從而篩選高產(chǎn)木聚糖酶釀酒酵母，并無直接對(duì)食品中轉(zhuǎn)基因微生物進(jìn)行的研究報(bào)道。轉(zhuǎn)基因微生物其在食品中的作用主要是生產(chǎn)次級(jí)代謝產(chǎn)物如酶制劑、食品添加劑等，近年來有發(fā)酵產(chǎn)物中出現(xiàn)未經(jīng)批準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因微生物的食品安全事件發(fā)生，已有研究者使用PCR方法及高通量測序方法對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中的轉(zhuǎn)基因微生物進(jìn)行檢測，因此在未來檢測中可考慮使用數(shù)字PCR方法對(duì)產(chǎn)物中的轉(zhuǎn)基兇微生物進(jìn)行鑒別及定量，為轉(zhuǎn)基因食品安全性評(píng)價(jià)提供更多可能。

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