4.2基于成分特有性的四逆散Q-marker預(yù)測(cè)分析

柴胡為傘形科植物柴胡Bupleurum chinense DC.或狹葉柴胡Bupleurum scorzonerifolium Willd.的干燥根，主要含有皂苷、揮發(fā)油、有機(jī)酸、黃酮及甾醇類，其中起主要作用的柴胡皂苷屬于三萜皂苷類化合物。三萜皂苷類成分主要通過(guò)甲戊二羥酸途徑合成，由3分子的乙酰輔酶A縮合后，在酶的作用下催化成了含有6個(gè)碳原子的甲羥戊酸（MVA），再經(jīng)過(guò)一系列的反應(yīng)得到了異戊烯焦磷酸（IPP），異戊烯焦磷酸異構(gòu)化變成了二甲丙烯焦磷酸（DMAPP）；IPP和DMAPP頭尾縮合得到了含有10個(gè)碳原子的焦磷酸香葉酯（GPP），進(jìn)一步在法尼基焦磷酸合酶（FPS）的作用下，將IPP與GPP結(jié)合產(chǎn)生了含有15個(gè)碳原子的法尼基焦磷酸（FPP）；2分子的FPP尾尾縮合，在鯊烯合酶（SS）的催化下生成了反式角鯊烯，再經(jīng)鯊烯環(huán)氧酶（SE）的作用，反式角鯊烯在C-2和C-3的位置環(huán)氧化成了2,3-氧化鯊烯；以2,3-氧化鯊烯為底物，經(jīng)過(guò)不同的反應(yīng)，分別得到了不同的三萜皂苷類化合物，合成途徑見(jiàn)圖2。

白芍為毛茛科植物芍藥Paeonia lactiflora Pall.的干燥根。有文獻(xiàn)報(bào)道白芍的化學(xué)成分主要有單萜及其苷類、三萜類、黃酮、鞣質(zhì)、多糖、揮發(fā)油等，其中單萜類成分芍藥苷含量較高且藥理活性較強(qiáng)。萜類成分主要通過(guò)甲戊二羥酸途徑合成，單萜類成分經(jīng)甲戊二羥酸（MVA）數(shù)步反應(yīng)轉(zhuǎn)化成異戊烯焦磷酸（IPP），IPP異構(gòu)化變成了二甲丙烯焦磷酸（DMAPP），IPP和DMAPP頭尾縮合得到焦磷酸香葉酯（GPP），GPP可反應(yīng)生成單萜類化合物，生物合成途徑見(jiàn)圖3。

枳實(shí)為蕓香科植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培變種或甜橙Citrus sinensis Osbeck的干燥幼果。枳實(shí)的主要化學(xué)成分為黃酮類、生物堿及揮發(fā)油，尤以黃酮類成分中的橙皮苷和柚皮苷含量較高，可作為指標(biāo)性成分進(jìn)行定性定量和提取工藝的研究。黃酮類成分由苯丙氨酸經(jīng)苯丙氨酸脫氨酶（PAL）轉(zhuǎn)化為肉桂酸，再經(jīng)肉桂酸-4-羥化酶（C4H）轉(zhuǎn)化為對(duì)羥基-香豆素，又通過(guò)4-香豆酰-CoA連接酶（4CL）轉(zhuǎn)化為4-香豆酰輔酶A在查爾酮合成酶（CHS）的作用下生成查爾酮，經(jīng)查爾酮異構(gòu)酶（CHI）的作用形成二氫黃酮，其他黃酮類化合物大都是經(jīng)過(guò)二氫黃酮在各種酶的催化作用下生物合成的，其合成途徑見(jiàn)圖4。

甘草為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、脹果甘草Glycyrrhiza inflata Bat.或光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的干燥根和根莖。研究表明，甘草的化學(xué)成分主要包三萜類、黃酮類、多糖、香豆素類、氨基酸、生物堿類、雌激素和有機(jī)酸類等化合物。三萜類和黃酮類為其主要有效成分，具有多種藥理作用，尤以甘草酸和甘草次酸含量較高，生理活性較強(qiáng)，較具特征性。三萜皂苷類成分生物合成見(jiàn)圖2，黃酮類成分生物合成途徑見(jiàn)圖4。

4.3基于成分與藥效關(guān)聯(lián)的四逆散Q-marker預(yù)測(cè)分析

質(zhì)量控制的根本目的是對(duì)中藥有效性的控制，將“藥性”和“藥效”均納入中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)，才能反映中藥質(zhì)量的完整性。因此，有效性也是中藥質(zhì)量標(biāo)志物確定的重要依據(jù)。藥理學(xué)研究表明，柚皮苷、甘草次酸兩種物質(zhì)是四逆散全方抗炎和免疫抑制藥效的主要效應(yīng)成分。戈宏焱通過(guò)研究柴胡皂苷對(duì)抑郁模型大鼠的作用，發(fā)現(xiàn)柴胡皂苷對(duì)大鼠海馬區(qū)的神經(jīng)具有保護(hù)作用，同時(shí)能提高核糖核酸（BDNF）含量，提示柴胡皂苷的抗抑郁作用是通過(guò)調(diào)節(jié)腦內(nèi)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子完成的。現(xiàn)代研究結(jié)果表明，柴胡抗抑郁的功效物質(zhì)基礎(chǔ)主要為皂苷類成分。還有細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)芍藥苷與柴胡皂苷a能有效緩解被皮質(zhì)酮損傷的PC12細(xì)胞中自噬流被抑制的現(xiàn)象，提高細(xì)胞自噬活性，從而提高PC12細(xì)胞的活性。枳實(shí)中的化學(xué)成分復(fù)雜，其中橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷等黃酮類成分均可改善功能性消化不良大鼠的胃排空和小腸推進(jìn)功能，其作用機(jī)制可能與增加胃動(dòng)素的分泌有關(guān)。李越峰通過(guò)研究大鼠腦脊液中四逆散的主要活性成分，發(fā)現(xiàn)給予四逆散凍干粉后，大鼠腦脊液中成分峰面積約是空白腦脊液峰面積的12.5倍，血清中四逆散的主要活性成分為辛弗林、芍藥苷、柴胡皂苷c及甘草次酸，均可以使腦脊液中該內(nèi)源性物質(zhì)峰面積高于空白腦脊液峰面積，初步認(rèn)定四逆散改善睡眠作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)是辛弗林、芍藥苷、柴胡皂苷c及甘草次酸混和物。徐甜等對(duì)四逆散抗抑郁有效靶點(diǎn)進(jìn)行挖掘，得到抗抑郁靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的藥效組分屬于柴胡的有7個(gè)，枳實(shí)的有12個(gè)，甘草的有87個(gè)，白芍的有1個(gè)。而所得的抗抑郁靶點(diǎn)中，柴胡的靶點(diǎn)有18個(gè)，枳實(shí)的靶點(diǎn)有11個(gè)，甘草的靶點(diǎn)有25個(gè)，白芍的靶點(diǎn)有17個(gè)。此外，侯磊等采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)四逆散干預(yù)焦慮癥作用機(jī)制進(jìn)行探究。結(jié)果表明，君藥柴胡中槲皮素、山柰酚等成分具有明顯的抗焦慮作用，其機(jī)制與提高小鼠腦內(nèi)γ-氨基丁酸（GABA）、谷氨酸（Glu）含量有關(guān)；臣藥芍藥中芍藥苷能降低血虛肝郁證模型大鼠環(huán)核苷酸（cGMP）含量，可以改善大鼠的抑郁、焦慮與學(xué)習(xí)記憶障礙等；佐藥枳實(shí)中橙皮苷是抗焦慮活性成分之一。上述研究表明柴胡皂苷a、柴胡皂苷c、芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、辛弗林和甘草次酸均可作為四逆散的主要藥效成分。

4.4基于復(fù)方配伍環(huán)境的四逆散Q-marker的預(yù)測(cè)分析

配伍是中藥復(fù)方的核心，復(fù)方通過(guò)配伍針對(duì)病或證的主要病理環(huán)節(jié)產(chǎn)生治療作用。盧健等以四逆散及不同配伍對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎的干預(yù)機(jī)制進(jìn)行研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)與模型組相比，四逆散及不同配伍能不同程度地減輕結(jié)腸組織的損傷，并能夠促進(jìn)實(shí)驗(yàn)性潰瘍結(jié)腸炎（UC）大鼠結(jié)腸病變組織修復(fù)。在促進(jìn)結(jié)腸組織修復(fù)方面，柴胡、芍藥發(fā)揮了君藥與臣藥的的重要配伍作用，甘草作為使藥，其協(xié)調(diào)作用主要體現(xiàn)在對(duì)胸腺細(xì)胞增殖的刺激。李越峰等對(duì)四逆散拆方過(guò)程中化學(xué)成分的變化進(jìn)行了分析研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，四逆散中柚皮苷、甘草酸含量高于去柴胡方中的含量；四逆散中芍藥苷溶出量明顯高于單煎物的溶出量；全方煎煮后，枳實(shí)中的柚皮苷、橙皮苷成分溶出量高于單煎物溶出量，且配伍枳實(shí)后四逆散中甘草酸含量明顯升高；配伍甘草后與去掉甘草相比，芍藥苷、橙皮苷、柚皮苷溶出量均有所增多。提示在配伍煎煮過(guò)程中，各成分間存在明顯的相互增溶作用。李軍等采用RP-HPLC法研究四逆散不同配伍對(duì)柴胡皂苷a、b2、柴胡總皂苷及甘草素、異甘草素煎出率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，四逆散不同配伍中，枳實(shí)中的成分可提高柴胡皂苷類成分的煎出量；枳實(shí)、白芍中的成分對(duì)甘草素和異甘草素有增溶作用；柴胡中的成分對(duì)甘草素和異甘草素有抑溶作用。然而，全方合煎時(shí)各種成分含量均能達(dá)到最優(yōu)，這也是四逆散配伍的巧妙之處。據(jù)以上分析可知柴胡皂苷a、芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷、甘草酸、甘草素可作為四逆散主要藥效成分。

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