2、線性與精密度考察

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液制備

GC：精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5、1.0、2.0、4.0、5.0mL分別置于10mL量瓶中，用無(wú)水乙醇定容，得標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，按色譜柱：AgilentZORBAXEclipseXDB-C18(4.6x250mm，5μm)，流動(dòng)相為甲醇(A)-20mmo/L乙酸銨溶液(B)，梯度洗脫(0～8min，10%A；8.1～20min，30%A；20.1～30min，10%A)，流速為1.0mL/min，進(jìn)樣量為10uL，柱溫為35℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm。HPLC：精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液0.04、0.4、1.0、1.5、2.0mL分別置于10mL量瓶中，用50%甲醇溶液定容，得標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。

GC-MS：精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液1mL置10mL量瓶中，加無(wú)水乙醇制成濃度為100μg/mL的對(duì)照品使用液，再精密量取0、0.4、0.2、0.5、1.0、2.0mL分別置于10mL量瓶中，用無(wú)水乙醇定容，得標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，按色譜條件:色譜柱為J&WDB-624UI(60mx0.25mmx1.4μm)，升溫程序?yàn)槌跏紲囟?0℃，保持1min，以50℃/min升溫至150℃，保持2min，再以10℃/min升溫至250℃，保持26min；載氣為氦氣，初始流量1mL/min，保持20min，以2mL/min升至2mL/min，保持20min，進(jìn)樣口溫度250℃，分流比10:1，進(jìn)樣量1μL。

（2）測(cè)定結(jié)果

分別以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，得線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)，測(cè)定結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明，三種方法的相關(guān)系數(shù)均達(dá)到＞0.999，且精密度RSD均＜2%，表明線性和精密度良好。

3、檢出限和定量限

精密量取各對(duì)照品溶液，以信噪比S/N=3和S/N=10為依據(jù)分別制成檢出限溶液和定量限溶液，GC、HPLC、GC-MS三種方法的檢出限分別5mgkg、10mg/kg和2mg/kg；定量限分別為17mg/kg、33mg/kg和6.7mg/kg?？梢?，GC-MS的檢出限最低，靈敏度相對(duì)較高，HPLC的檢出限相對(duì)較高，靈敏度相對(duì)較低。

4、回收率考察

取已知含量的某口服液0.5g各9份，根據(jù)曲線范圍，按低、中、高濃度分別精密加入各自的對(duì)照品儲(chǔ)備液(GC加入1、3、5mL，HPLC加入1、2、3mL，GC-MS加入0.1、0.3、0.5mL)，每個(gè)濃度3份，按各自的溶液制備方法制備回收率溶液，三種方法的回收率測(cè)定結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明，三種方法的回收率均在90%～100%之間，方法的準(zhǔn)確性良好。

5、穩(wěn)定性考察

取三種方法制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線中點(diǎn)濃度溶液和回收率考察的樣品溶液，在室溫條件下，分別于0、0.5、1、2、4、8、16、24h時(shí)在各自的色譜條件下測(cè)定，計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)苯甲醇峰面積的RSD%。GC為1.1%、1.3%，HPLC為0.8%、0.9%，GC-MS為1.4%、1.3%，均小于2%，表明三種方法在室溫下具有良好的穩(wěn)定性，能滿足日常檢驗(yàn)的需求。

6、樣品前處理方法的考察

依據(jù)GB5009.28-201方法，取含蛋白質(zhì)的樣品1.0g，加入適量的苯甲醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，再加入92g/L亞鐵氰化鉀和183g/L乙酸鋅溶液各0.5mL后，精密稱取苯甲醇對(duì)照品25mg置于10mL量瓶中，加50%甲醇溶液稀釋并定容，得對(duì)照品儲(chǔ)備液。取樣品混勻，精密稱取1.0g置于25mL量瓶中，加適量50%甲醇溶液超聲提取10min，冷卻至室溫后定容，0.22μm濾膜濾過，得樣品溶液高效液相色譜法項(xiàng)下制備樣品溶液并測(cè)定含量，并與未加入蛋白質(zhì)沉淀劑的加標(biāo)樣品溶液測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果表明，蛋白質(zhì)沉淀劑對(duì)苯甲醇的測(cè)定無(wú)影響。

依據(jù)GB5009.139-2014方法，取含苯甲醇的樣品1.0g，置于25mL量瓶中，加適量50%甲醇溶液超聲提取10min后定容至刻度，再加入0.5g輕質(zhì)氧化鎂混勻，0.22μm濾膜濾過后按色譜柱：AgilentZORBAXEclipseXDB-C18(4.6x250mm，5μm)，流動(dòng)相為甲醇(A)-20mmo/L乙酸銨溶液(B)，梯度洗脫(0～8min，10%A；8.1～20min，30%A；20.1～30min，10%A)，流速為1.0mL/min，進(jìn)樣量為10uL，柱溫為35℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm色譜條件測(cè)定含量，并與未加入氧化鎂的樣品測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果表明，輕質(zhì)氧化鎂對(duì)苯甲醇的測(cè)定無(wú)影響。

依據(jù)GB5009.140-2003方法，取含苯甲醇的樣品1.0mL，置于中性氧化鋁(100～200目)柱中，用50%甲醇溶液洗脫至25mL容量瓶中，0.22μm濾膜濾過后測(cè)定含量，并與未過中性氧化鋁柱的樣品測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果表明，中性氧化鋁柱對(duì)苯甲醇的測(cè)定無(wú)影響。

7、樣品的測(cè)定

收集市售的40批液體型保健食品，精密稱取苯甲醇對(duì)照品50mg置于50mL量瓶中，加無(wú)水乙醇稀釋并定容，得對(duì)照品儲(chǔ)備液。取樣品混勻，精密稱取1.0g，置于10mL量瓶中，加無(wú)水乙醇溶解并超聲提取10min，冷卻至室溫后定容，0.22μm濾膜濾過，得樣品溶液。精密稱取苯甲醇對(duì)照品25mg置于10mL量瓶中，加50%甲醇溶液稀釋并定容，得對(duì)照品儲(chǔ)備液。取樣品混勻，精密稱取1.0g置于25mL量瓶中，加適量50%甲醇溶液超聲提取10min，冷卻至室溫后定容，0.22μm濾膜濾過，得樣品溶液。對(duì)照品儲(chǔ)備液同氣相色譜法項(xiàng)下儲(chǔ)備液。取樣品混勻，精密稱取1.0g，置于10mL量瓶中，加無(wú)水乙醇溶解并超聲提取10min后定容，0.22μm濾膜濾過，精密量取續(xù)濾液0.1mL置于10mL量瓶中，加無(wú)水乙醇定容，得樣品溶液。

在色譜柱:J&WDB-WAX(60mx0.25mmx0.25μm)，升溫程序?yàn)槌跏紲囟?50℃，10℃/min升到180℃，保持3min，20℃/min升到230℃，保持5min；載氣為氮?dú)?，恒流速?.0mL/min，分流比10:1，檢測(cè)器溫度250℃，進(jìn)樣口溫度240℃，進(jìn)樣量1μL。色譜柱:AgilentZORBAXEclipseXDB-C18(4.6x250mm，5μm)，流動(dòng)相為甲醇(A)-20mmo/L乙酸銨溶液(B)，梯度洗脫(0～8min，10%A；8.1～20min，30%A；20.1～30min，10%A)，流速為1.0mL/min，進(jìn)樣量為10uL，柱溫為35C，檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm。色譜條件:色譜柱為J&WDB--624UI(60mx0.25mmx1.4μm)，升溫程序?yàn)槌跏紲囟?0℃，保持1min，以50℃/min升溫至150℃，保持2min，再以10℃/min升溫至250℃，保持26min；載氣為氦氣，初始流量1mL/min，保持20min，以2mL/min升至2mL/min，保持20min，進(jìn)樣口溫度250℃，分流比10:1，進(jìn)樣量1μL條件下測(cè)定，根據(jù)苯甲醇標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍調(diào)整樣品的稀釋體積，結(jié)果表明，有7批樣品檢出含苯甲醇，三種方法的測(cè)定結(jié)果一致(見表3)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%。

7、三種方法比較

GC是測(cè)定揮發(fā)性或半揮發(fā)性成分的首選方法，其靈敏度好，進(jìn)樣量小，檢測(cè)效率較高，檢測(cè)成本低，但是僅采用保留時(shí)間定性，當(dāng)樣品中有雜質(zhì)干擾時(shí)，需要調(diào)整升溫程序?qū)崿F(xiàn)最佳分離效果。

HPLC是實(shí)驗(yàn)室最普及的檢測(cè)手段，在測(cè)定苯甲醇含量時(shí)，可以根據(jù)光譜圖進(jìn)行定性判定，但由于苯甲醇的最大吸收波長(zhǎng)在210nm附近，屬末端吸收，沒有明顯的吸收特征，當(dāng)有雜質(zhì)干擾時(shí)，可能會(huì)影響判定的準(zhǔn)確性。但從本文的測(cè)定結(jié)果看，本方法與測(cè)定波長(zhǎng)相近的10-羥基癸烯酸等功效性指標(biāo)的分離度很高，受雜質(zhì)干擾較少。

GC-MS相比前兩種方法，其靈敏度最高，根據(jù)質(zhì)譜圖定性判定，并可準(zhǔn)確定量，但儀器使用和維護(hù)成本較高，推薦作為GC和HPLC的輔助判定方法。

三、結(jié)論

本文建立的三種苯甲醇測(cè)定方法操作簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確性高，穩(wěn)定性好，實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)條件選擇適宜的檢驗(yàn)方法。三種方法相比，推薦使用HPLC法進(jìn)行測(cè)定，GC-MS法輔助判定，也可直接采用GC-MS法，提高監(jiān)測(cè)效率。

《保健食品備案產(chǎn)品可用輔料及其使用規(guī)定(2019年版)》中規(guī)定的苯甲酸及其鈉鹽在液體制劑中的最大使用量為1g/kg；在GB/T2731-2017《日用香精》1161中規(guī)定，芐醇(即苯甲醇)在第1類加香產(chǎn)品(唇用產(chǎn)品、玩具)中，最高限量為0.2%(即2g/kg)；根據(jù)JECFA提出的芐基化合物的總使用限值要求0～5mgkg體重(以苯甲酸當(dāng)量計(jì))，以成年人體重60kg計(jì)算，苯甲酸類ADI為0～300mg/d這幾個(gè)標(biāo)準(zhǔn)均可作為制定食品或保健食品中苯甲醇限量的參考依據(jù)。

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