一、目的要求

1、學(xué)習(xí)及了解高效液相色譜儀的工作原理及操作要點(diǎn)。

2、掌握高效液相色譜法測(cè)定三聚氰胺的原理及方法。

3、學(xué)會(huì)使用高效液相色譜儀、學(xué)會(huì)識(shí)別色譜圖。

4、掌握固相萃取柱的使用方法。

5、了解三聚氰胺的來源、用途和主要危害。

二、實(shí)驗(yàn)原理

試樣中的三聚氰胺用三氯乙酸溶液提取，提取液離心后經(jīng)混合型陽離子交換固相萃取柱凈化，洗脫物吹干后用流動(dòng)相溶解，用高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。

三、實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

1、試劑

①甲醇：色譜純。

②乙腈：色譜純。

③氨水：濃度25％～28％。

④混合型陽離子交換固相萃取柱：60mg，3mL。

⑤三氯乙酸溶液(10g/L)：稱取10g三氯乙酸，加水至1000mL。

⑥氨化甲醇溶液：準(zhǔn)確量取5mL氨水和95mL甲醇，混勻后備用。

⑦乙酸鉛溶液(22g/L)：取22g乙酸鉛，用約300mL水溶解后定容至lL。

⑧濾膜：0.45μm，有機(jī)相。

⑨甲醇水溶液：50mL甲醇加入50mL水，混勻。

⑩離子對(duì)試劑緩沖液：稱取2.02g庚烷磺酸鈉和2.10g檸檬酸于1L容量瓶中，加水溶解稀釋至刻度。

?三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品：純度＞99％。

A．三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：稱取lOOmg(精確到0.1 mg)的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇水溶液溶解并定容于100mL容量瓶中，該溶液濃度為lmg/mL，于4℃避光保存，有效期3個(gè)月。

B．三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)中間液：吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液5.OOmL，于50mL容量瓶?jī)?nèi)，用甲醇水溶液定容至，50mL，該溶液i聚氰胺濃度為lOOμg/L，于4℃避光保存，有效期1個(gè)月。

C．三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)工作液：用流動(dòng)相將三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)中間液逐級(jí)稀釋得到濃度為1．0μg/mL，5.0μL/mL，10μg/mL，25μg/mL，50μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

2、儀器

①高效液相色譜儀，配有紫外檢測(cè)器或二極管陣列檢測(cè)器。

②離心機(jī)：轉(zhuǎn)速不低于4000r/min。

③渦旋混合器。

④超聲波清洗器。

⑤氮?dú)獯蹈蓛x。

⑥同相萃取裝置。

四、實(shí)驗(yàn)步驟

1、提取

稱取2.00g試樣置于50mL具塞離心管中，準(zhǔn)確加入20mL三氯乙酸溶液(10g/L)，加入

2mL乙酸鉛溶液(22g/L)，搖勻，超聲提取20min。靜置2min，以不低于4000r/min離心10min，上層液待凈化。

2、凈化

分別用3mL甲醇，3mL水活化混合型陽離子交換固相萃取柱，準(zhǔn)確移取10mL離心液分次上柱，控制過柱速度在1mL/min以內(nèi)。依次用3mL水和3mL甲醇洗滌，抽至近干后，用6mL氨化甲醇溶液洗脫。洗脫液500C下氮?dú)獯蹈?，殘留物?mL流動(dòng)相定容，渦旋混合1min，過微孔濾膜后，供HPLC測(cè)定。同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)。

3、高效液相色譜條件

①色譜柱：C8柱，柱長(zhǎng)150mm，內(nèi)徑4.6mm，粒度5μm；或性能相當(dāng)?shù)纳V柱。

②柱溫：室溫。

③流動(dòng)相：離子對(duì)試劑緩沖液(三、1．⑨)-乙腈(90:10)，混勻。

④流速：1.0mL/min。

⑤檢測(cè)波長(zhǎng)：240nm。

⑥進(jìn)樣量：20μL。

五、結(jié)果處理

              (8-16)

式中：X——試樣中l(wèi)一聚氰胺的含量，mg／kg；

A——樣液中三聚氰胺的峰面積，積分單位；

c——標(biāo)準(zhǔn)溶液中j聚氰胺的質(zhì)量濃度，μg/mL；

V——樣液最終定容體積，mL；

As——標(biāo)準(zhǔn)溶液中三聚氰胺的峰面積，積分單位；

m——試樣的質(zhì)量，g；

f——稀釋倍數(shù)。

六、注意事項(xiàng)

1、本方法的定量限為2mg/g。

2、回收率：在添加濃度2mg/kg～lOmg/kg濃度范圍內(nèi)，回收率在80％～110％之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10％。

3、精密度：在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過算術(shù)平均值

的10％。

參考資料：食品中有毒有害物質(zhì)檢測(cè)