β-甘露聚糖酶（EC 3.2.1.78）是一類作用于β-1,4-甘露糖苷鍵的內切水解酶，廣泛分布于軟體動物、植物和微生物中，其中微生物來源的甘露聚糖酶資源最為豐富。作為一種新興的食品加工用酶，甘露聚糖酶可應用在寡糖的制備、面包品質的改良、乳制品增稠加工及果汁飲料穩(wěn)定性等領域。目前，GH5家族和GH26家族來源的甘露聚糖酶被進行了廣泛研究，而另外兩個家族，尤其是GH134家族甘露聚糖酶報道的信息較少。本課題組前期探究了GH5家族甘露聚糖酶NsMan5B對果汁澄清效果的評價，發(fā)現(xiàn)除橘子汁外，該重組酶對其他果汁的澄清度都有不同程度的提高，其中柿子汁澄清度提高了31.8%，蘋果汁、桃汁、葡萄汁的澄清度分別提高7%、4%和4%。而關于GH134家族的甘露聚糖酶在果汁加工的應用還鮮有相關報道。

近日，河北農業(yè)大學食品科技學院擬對嗜熱真菌小孢根霉（Rm）HBFH10中GH134家族甘露聚糖酶基因進行克隆、表達及酶學性質的研究，探究其在果汁加工過程中的應用潛力。

1 嗜熱菌HBFH10的分離及鑒定

從河北省鳳來儀酒業(yè)有限公司大曲中篩選獲得1 株真菌HBFH10，由A、B經菌株生長溫度測定結果可知，菌株HBFH10在19 ℃下無法正常生長，而能夠在45 ℃條件下正常生長，符合嗜熱真菌生長溫度特點要求，判定HBFH10菌為嗜熱真菌。使用ITS1和ITS4引物進行18S基因間隔區(qū)域的擴增，最終獲得800 bp左右PCR產物。利用BLAST軟件分析發(fā)現(xiàn)與Rm strain D4-1（GQ502280.1）一致性最高，為99%，通過進化樹分析菌株HBFH10屬于Rm，最終將該菌命名為Rm HBFH10。

2 甘露聚糖酶RmMan134基因序列分析

經對多條GH134氨基酸序列對比發(fā)現(xiàn)，該家族甘露聚糖酶存在2 個保守區(qū)域。保守I區(qū)序列（NFGIFKQNW），活性催化位點位于該區(qū)域中，該區(qū)域結構主要為Loop結構，由于Loop結構具有較強的柔性特點，這為底物的識別及催化提供了便利；保守II區(qū)序列（DDTRFWVD），該區(qū)域相對而言最為保守，該區(qū)域主要是β折疊片結構。在上述兩區(qū)域設計GH134家族的兼并引物。本研究利用兼并引物Man134UF和Man134UR對Rm HBFH10基因組DNA進擴增，獲得1 個基因保守片段，測序結果表明該基因為GH134家族的甘露聚糖酶基因的部分序列，并且與菌株Rm ATCC 52813基因組中的假使蛋白基因（CEG81741.1）序列一致性為98%。進一步分析發(fā)現(xiàn)RmMan134基因由552 bp堿基組成，沒有內含子序列，編碼183 個氨基酸和1 個終止密碼子。

RmMan134基因與已報道的GH134家族甘露聚糖酶的一致性對比分析，該基因與已報道GH134家族基因的氨基酸序列一致性較低（＜69.6%），表明RmMan134基因具有一定的新穎性，具有理論研究價值。其中與甘露聚糖酶AoMan134（XP_023093135.1）一致性為45.2%，與甘露聚糖酶SsMan134（PDB，5JTS）一致性為51.6%，與甘露聚糖酶RmMan134A（MF538624）一致性為69.6%，與甘露聚糖酶AnMan134（ANID_02710）一致性為51%。RmMan134具有α/β結構，屬于Clan-A超家族，含有催化保守氨基酸（E55和D67），分別位于第2個和第3個α螺旋結構中。

3 重組菌RmMan134基因誘導表達及產物的SDSPAGE分析

表達質粒pPIC9k-RmMan134經Bgl II限制酶線性化后，電擊轉入畢赤酵母GS115感受態(tài)細胞，在MD平板上培養(yǎng)，挑取48 個轉化子進行小管誘導，畢赤酵母采用兩段法進行異源基因誘導表達。從48 個轉化子中篩選得到32 株具有甘露聚糖酶活力的轉化子。將重組菌株進行誘導表達之后，對細胞發(fā)酵液進行酶活力檢測，發(fā)酵液中酶活力為7.8 U/mL。發(fā)酵酶液800 mL經12 000×g離心10 min去除酵母細胞及培養(yǎng)基，收集上清液，之后將上清酶液進行膜包（10 kDa）濃縮處理，使?jié)饪s后的酶液為30 mL左右。如SDS-PAGE檢測重組酶RmMan134表觀分子質量約為22 kDa，比理論分子質量18.5 kDa偏大，經糖基化預測分析發(fā)現(xiàn)RmMan134酶蛋白分子存在1 個N-糖基化位點（NKSG）。

4 重組菌RmMan134酶學特性分析

重組酶 RmMan134的最適反應溫度為 5 0 ℃，該酶的反應溫度范圍較廣，30～80 ℃都能夠檢測到該酶活力，在70 ℃反應下具有30%以上酶活力，在80 ℃時能夠維持20%以上活力。

重組酶RmMan134具有較廣的pH值作用范圍，在pH 2.0～11.0范圍內都表現(xiàn)出一定的酶活力，該酶的最適反應pH 6.0，在酸性范圍內（3.0＜pH＜7.0）酶活力較高，能夠維持60%以上酶活力。隨著pH值的逐漸升高，酶活力也隨之降低。

分析重組酶 RmMan134的熱穩(wěn)定性研究發(fā)現(xiàn)，在50 ℃條件下，重組酶RmMan134處理1 h后，能夠維持60%以上酶活力；而60 ℃處理1 h后，酶活力損失約60%。分析其pH值耐受性發(fā)現(xiàn)，該酶在pH 4.0～8.0范圍內處理1 h后酶活力基本維持穩(wěn)定，即使在堿性條件下（7.0＜pH＜11.0）依然能夠維持75%以上酶活力，而在強堿條件下，重組酶極不穩(wěn)定，酶活力喪失較明顯。

將重組酶RmMan134對角豆膠活性定義為100%，則對底物魔芋膠、果膠、CMC-Na和木聚糖的活力分別為114.8%、44.9%、7.2%和19.6%。以魔芋膠為底物時，設定底物質量濃度的倒數（1/[S]）為橫坐標，以反應速率倒數（1/V）為縱坐標，獲得雙倒數曲線：Y=0.0116X＋0.0175，R2=0.998，計算酶的動力學參數V max為57.1 μmol/（min·mg），Km為0.66 mg/mL。

5 重組菌RmMan134對5種果汁的影響

除了杏汁和葡萄汁外，重組酶RmMan134對其他果汁的澄清度都有不同程度的提高，其中橙汁提高的最為明顯，提高了23.8%。其次蘋果汁提高了11%，桃汁提高了7%左右。在酶解杏汁和葡萄汁時，很有可能是杏汁和葡萄汁中的單寧及多酚物質與重組酶RmMan134交聯(lián)在一起，影響了果汁的澄清度。除此之外，重組甘露聚糖酶的添加使得葡萄汁出汁率提高了7%左右，而重組酶并未增加上述5 種水果的總還原糖量。

6 討論

本研究成功從濃香大曲中篩選獲得了1 株嗜熱真菌HBFH10，經鑒定為Rm。目前，微孢根霉菌種在食品生產中起著重要作用，已從Rm中獲得了淀粉酶、植酸酶酶和脂肪酶等。本研究從嗜熱真菌Rm HBFH10中克隆得到一個新的甘露聚糖酶基因（RmMan134）。

甘露聚糖酶分為GH5、GH26、GH113和GH134家族，GH113家族甘露聚糖酶的分布極其有限，繼而限制了該家族酶的進一步挖掘。GH134家族的酶氨基酸序列長度非常短，一般長度為180 aa左右，遠低于其他3 類家族的300～500 aa，這一特點使得只需要30%左右的氨基酸材料就可以合成出所需要的甘露聚糖酶，在本研究中，甘露聚糖酶RmMan134除含有GH134家族的催化結構域外，還含有一個18 aa組成的信號肽序列，這使得該蛋白可以分泌到細胞之外參與糖類的代謝活動。經多條序列比對分析發(fā)現(xiàn)，GH134家族甘露聚糖聚糖酶N端往往含有信號肽序列特征，與GH5和GH26家族相似，這也說明該類家族也很有可能在微生物中廣泛分布。

重組酶RmMan134的最適pH值為6.0，這與GH134家族其他 β - 甘露聚糖酶最適 p H 值十分相似，同樣來源Rm的甘露聚糖酶RmMan134A的最適pH值為5.0，在pH 7.0～11.0堿性條件下往往表現(xiàn)出非常低的酶活力，甚至會喪失全部酶活力，而對于甘露聚糖酶RmMan134來說，依然能保持20%～70%以上酶活力，同樣的差異與Streptomyces sp. NRRL B-24484的甘露聚糖酶也比較明顯。

RmMan134更適合在中性pH值環(huán)境發(fā)揮作用，這兩個同功酶的存在使得Rm對環(huán)境具有較強適應能力。RmMan134與RmMan134A具有相同的最適溫度（50 ℃）。進一步分析發(fā)現(xiàn)，RmMan134較RmMan134A具有較高的酶反應溫度和較好的熱穩(wěn)定性。在反應溫度為80 ℃時，RmMan134表現(xiàn)出20%酶活力，而RmMan134A則喪失酶活力。且酶熱穩(wěn)定性能的差異依然明顯，RmMan134在60 ℃條件下處理30 min依然可以維持50%左右酶活力，而RmMan134A酶活力基本消失。重組酶RmMan134是目前GH134家族反應溫度最高的酶，但隨著研究的進一步深入，GH134家族來源的嗜熱甘露聚糖酶應該很快會被挖掘出來。

甘露聚糖酶可有效的降解甘露聚糖，目前已成為果汁加工中一種新型酶制劑而被加以利用，鑒于GH134家族甘露聚糖酶的最適底物為葡甘露聚糖，因此推測很可能是水果中甘露聚糖種類造成了重組甘露聚糖酶RmMan134A對不同果汁澄清效果的差異，其中對橙汁的澄清效果最為明顯，使橙汁澄清度提高了約76%，優(yōu)于來自Lactobacillus casei HDS-01甘露聚糖酶的澄清效果，相似的差異在P. acidilactici（M17）來源的甘露聚糖酶也有所體現(xiàn)。分析發(fā)現(xiàn)L. casei HDS-01菌的甘露聚糖酶屬于GH26家族，而GH26家族和GH134家族采用不同的催化機制，同時作用底物也存在差異，這很可能是造成上述差異的主要原因，而更信服的結論仍需進一步進行研究。

7 結論

本研究成功從濃香大曲中篩選出嗜熱真菌RmHBFH10，并從該菌中挖掘到了1 個假使蛋白，經分析為新型GH134家族甘露聚糖酶（RmMan134）。研究發(fā)現(xiàn)，重組甘露聚糖酶RmMan134在pH 6.0和50 ℃下表現(xiàn)出了最佳活性，并且在從酸性到堿性的廣泛pH值范圍內具有較高活性（2.0～11.0），在寬泛pH值范圍內和在50℃條件下具有出色的穩(wěn)定性。另外，重組酶RmMan134可以有效地澄清橙汁、桃汁和蘋果汁，其中可使橙汁的澄清度提高約76%。

相關鏈接：β-甘露聚糖酶，嗜熱小孢根霉，酵母細胞，氨基酸，木聚糖，偉業(yè)計量

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