2.2.4 加熱時(shí)間的影響

為探究加熱時(shí)間對(duì)顯色的影響，1 mL 64 mg·L^-1的 GABA水溶液、1 mL pH=7磷酸緩沖溶液和2 mL 1.8 g·L^-1的水合茚三酮醇溶液，混勻定容后，100℃下沸水浴不同時(shí)間，冷卻后用水定容至5 mL搖勻，測(cè)567 nm處的吸光度。由圖2 d可知：吸光度隨加熱時(shí)間延長(zhǎng)整體呈增加趨勢(shì)。加熱時(shí)間小于10 min時(shí)，吸光度很小，說明顯色產(chǎn)物的量極少，反應(yīng)很不完全；沸水浴10～40 min時(shí)，吸光度隨加熱時(shí)間迅速增加，超過40 min后增加的趨勢(shì)明顯減緩。這說明水合茚三酮與GABA反應(yīng)需要加熱時(shí)間足夠，顯色反應(yīng)才能完全，本文確定60 min為最佳顯色加熱時(shí)間。

2.3 茚三酮顯色法測(cè)定GABA的性能評(píng)價(jià)

2.3.1 線性范圍和檢出限

以試劑空白為參比，對(duì)不同濃度的GABA在優(yōu)選條件下經(jīng)水合茚三酮顯色后測(cè)定，以吸光度對(duì)GABA的濃度作圖，得水合茚三酮顯色測(cè)定GABA的工作曲線。對(duì)結(jié)果進(jìn)行擬合，結(jié)果表明：在0.5～80 mg·L^-1的濃度范圍內(nèi)，吸光度(y)與GABA濃度(x)符合方程 y=0.01234x-0.00113，R2=0.99983，線性較好。根據(jù)三倍標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算得到該方法測(cè)定GABA的檢出限為21.6 μg·L^-1，靈敏度較高。

2.3.2 重現(xiàn)性與抗干擾實(shí)驗(yàn)

良好的重現(xiàn)性是進(jìn)行準(zhǔn)確分析測(cè)定的前提。通過水合茚三酮顯色，對(duì)相同濃度的GABA溶液進(jìn)行7次平行顯色，每份重復(fù)測(cè)定3次。經(jīng)計(jì)算可知，平均吸光度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.026%，說明該方法精密度高，重現(xiàn)性好。

一定的選擇性是保證分析結(jié)果準(zhǔn)確度的關(guān)鍵。為此，本文通過對(duì)比40 mg·L^-1 GABA在加入不同干擾物前后的吸光度值變化來研究該方法的抗干擾能力。干擾物的選擇主要是樣品中可能存在的共存組分和根據(jù)顯色原理可能會(huì)干擾的一些物質(zhì)。首先分別測(cè)定40 mg·L^-1 GABA水溶液和相同GABA濃度但添加有不同濃度干擾物的混合液顯色后的吸光度，然后以不加干擾時(shí)的吸光度值為分母，以添加干擾物后的吸光度為分子，計(jì)算所得比值可表示加入干擾后吸光度的相對(duì)變化。比值越接近1，說明該物質(zhì)干擾越小。由圖3知，加入1.5 mg·L^-1淀粉(Starch)、15 mg·L^-1聚乙二醇8000(PEG 8000)、45 mg·L-1 Fe3+、30 mg·L-1 Fe2+、15 mg·L^-1氯化亞錫和15 mg·L^-1二氧化鈰時(shí)的比值都在0.97～1.02之間，說明上述干擾物對(duì)茚三酮顯色法測(cè)定40 g·L^-1 GABA的干擾較小，相對(duì)誤差不超過3%，該方法具有一定的抗干擾能力。

2.4 樣品測(cè)定和結(jié)果確認(rèn)

為避免樣品中可能存在的其他氨基酸或蛋白質(zhì)等對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，將含有GABA的食品添加劑配成100 mg·L^-1 的水溶液，再對(duì)其進(jìn)行薄層色譜分離，取相應(yīng)斑點(diǎn)溶解后，在選定條件下測(cè)吸光度，計(jì)算出GABA的濃度為45.51 mg·L^-1，即GABA在樣品中含量為45.51%。

為檢驗(yàn)樣品測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，進(jìn)行了三個(gè)不同濃度的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表1所示，加標(biāo)回收率在95.4～117.6%范圍內(nèi)，說明準(zhǔn)確度較好。

此外，為進(jìn)一步檢驗(yàn)樣品測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，排除薄層色譜未將GABA與其他氨基酸分離的可能，將2.5 g·L^-1 GABA、0.25 g·L^-1 L-苯丙氨酸和0.25 g·L^-1L-組氨酸的混合液在相同色譜條件下分離，結(jié)果如圖4所示。1號(hào)位為L(zhǎng)-組氨酸，2號(hào)位為GABA，3號(hào)位為L(zhǎng)-苯丙氨酸，這說明在此條件下GABA可被有效分離。

綜上可知，利用本文所建立的方法可較準(zhǔn)確地測(cè)定GABA的含量。

3 結(jié)論

基于目前文獻(xiàn)報(bào)道的水合茚三酮顯色測(cè)定氨基酸的條件有明顯差異，考慮到氨基酸結(jié)構(gòu)不同可能導(dǎo)致顯色條件和測(cè)定波長(zhǎng)不同，本文針對(duì)在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域具有重要研究意義的GABA，研究了不同溶劑、顯色酸度、顯色劑用量、顯色溫度和時(shí)間等因素對(duì)水合茚三酮與GABA顯色反應(yīng)的影響，發(fā)現(xiàn)在pH=7.0時(shí)，0.5 mg·L^-1～80 mg·L^-1濃度范圍內(nèi)的GABA與1.8 g·L^-1水合茚三酮乙醇溶液沸水浴60 min， 反應(yīng)生成的有色產(chǎn)物在567 nm處的吸光度與GABA濃度線性關(guān)系良好，確立了一種利用水合茚三酮定量測(cè)定GABA的簡(jiǎn)單方法。實(shí)驗(yàn)證明，該方法有較好的重現(xiàn)性和一定的選擇性，結(jié)合薄層色譜對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行分析和結(jié)果驗(yàn)證，準(zhǔn)確度較高。本文所建立的方法不僅可直接用于一些樣品中GABA的定量檢測(cè)，也可作為液相色譜的檢測(cè)手段，這在當(dāng)前GABA被日益廣泛關(guān)注和大量應(yīng)用的情況下具有重要意義。

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