①測(cè)定DPPH·清除能力

參考Kumaran等及Floegel等的方法并作改進(jìn)。將單樅茶酒樣品作一系列濃度地稀釋，將每一稀釋度樣品溶液加到2支5mL試管中，每支試管加0.2mL樣品液；然后在一支試管中加入1×10^-4mol/L的DPPH乙醇溶液3.8mL，在另一支試管中加入3.8mL乙醇，兩支試管充分搖勻后于室溫下置于黑暗處孵育30min，然后于波長(zhǎng)517nm處測(cè)定吸光度。用乙醇作空白。按下式計(jì)算DPPH·清除率(I_D)：

I_D(％)=[1～(A₁—A₂)／Ao]×100

式中，A₁：0.2mL茶酒樣液+3.8mLDPPH乙醇溶液的吸光度；

A₂：0.2mL茶酒樣液+3.8mL乙醇的吸光度；

Ao：0.2mL乙醇+3.8mLDPPH乙醇溶液吸光度。

②測(cè)定ABTS·清除能力

參照Dudonne等的方法并作改進(jìn)。取7mmol／L的ABTS溶液5mL，加入到88μL0.14mol／LK₂S₂O₈溶液中，混勻，室溫下避光靜置12h，即得ABTS·儲(chǔ)備液。實(shí)驗(yàn)前用10mmo/LpH7.4的磷酸緩沖液稀釋成工作液，使其在波長(zhǎng)734nm下吸光度為0.70±0.02。將單樅茶酒作一系列濃度地稀釋，取10μL樣品液加到200μLABTS工作液中，混勻并靜置6min后測(cè)定波長(zhǎng)405nm下的吸光度。以純?nèi)軇┳骺瞻住０聪率接?jì)算ABTS·清除率(I_A)：

I_A(％)=(1-A₁／Ao)×100

式中，A₁：茶酒樣液的吸光度；

Ao：空白的吸光度。

③測(cè)定·OH清除能力

參考候?qū)W敏等的方法并稍作改進(jìn)。將單樅茶酒樣品液用dd水作一系列濃度地稀釋。取10mL小試管若干，分別依次加入8mmol／。FeS0₄溶液2mL、8mmol／L水楊酸-乙醇溶液2mL以及不同濃度的單樅茶酒樣品液2mL，以dd水作空白，最后加入8.5mol／LH₂0₂溶液2mL，搖勻后于40℃水浴中靜置20min，然后4000r/min離心5min，取上清液于波長(zhǎng)510nm處測(cè)定吸光度，參比溶液以dd水替代H₂O₂溶液。按下式計(jì)算·0H清除率(I_H)：

I_H(％)=[1-(A_n-A_d)／A_o]×100

式中，A_o：空白吸光度；

A_n：加入茶酒樣液后吸光度；

A_d：參比溶液吸光度。

④測(cè)定0₂^-·清除能力

參考PaVithm等及候?qū)W敏等的方法并作改進(jìn)。取10mL小試管若干，分別加入4.5mLpH8.O的Tris-鹽酸緩沖液，于30℃水浴中靜置15min，在各試管中分別加入0.2mL不同濃度的單樅茶酒樣品液以及30℃預(yù)熱過的3mmol／L的鄰苯三酚溶液0.3mL(用10mmo/L鹽酸配制)，搖勻后于30℃水浴中靜置5min，然后迅速加入5滴8mol/L鹽酸終止反應(yīng)。用dd水作空白對(duì)照，在波長(zhǎng)325nm處測(cè)定吸光度。按下式計(jì)算O₂^-·清除率(Is)：

I_s(％)=(A_o-A_n)／A_o×100

式中，A_o：空白的吸光度；

A_n：加入茶酒樣液后的吸光度。

（4）抗氧化能力指數(shù)(ORAC)的測(cè)定

ORAC法是抗氧化研究領(lǐng)域關(guān)注較多的一種抗氧化活性評(píng)價(jià)方法，目前已成功應(yīng)用于生物制品、食品、化學(xué)品及天然植物提取物等多種樣品的抗氧化能力分析。具體測(cè)定步驟如下：

①準(zhǔn)確稱取AAPH0.414g，用75mmol／LpH7.4的磷酸緩沖液溶解并定容至10mL，即得153mmol／L的AAPH溶液。

②準(zhǔn)確稱取FL0.04g，用75mmol／LpH7.4的磷酸緩沖液溶解并定容至25mL，即得4.25mmol/L的FL貯液甲；吸取FL貯液甲0.05mL并以磷酸緩沖液定容至50mL，即得4.25×10-3mmol／L的FL貯液乙；然后將FL貯液甲和FL貯液乙置于4℃?zhèn)溆谩?shí)驗(yàn)時(shí)吸取FL貯液乙0.5mL并以磷酸緩沖液定容至25mL，可得8×10-3mmo兒的稀釋液。

③準(zhǔn)確稱取2.5mgTrolox，用甲醇溶解并定容至10mL，即得1mmol／L的Trolox溶液。實(shí)驗(yàn)時(shí)分別吸取Trolox溶液l、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1mL于10mL容量瓶，用75mmol/LpH7.4磷酸緩沖液定容，即得不同濃度Trolox溶液。

④量取單樅茶酒10mL置于lL容量瓶中，用75mmol/LpH7.4磷酸緩沖液定容，即得10mL/L的樣品液。

⑤量取100μLFL稀釋液置于96孔熒光板中，用酶標(biāo)儀在激發(fā)波長(zhǎng)490nm、發(fā)射波長(zhǎng)514nm下測(cè)定熒光值(記作‰)。然后，加入不同濃度的TroloX溶液50μL并振搖2min，37℃下孵育8min后立即加入50μLAAPH溶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)。反應(yīng)期間，每隔2min便測(cè)一次熒光值(記作A_n)，直至熒光值衰減成直線。由下式計(jì)算熒光衰退曲線下的面積(AUC)，計(jì)算保護(hù)面積(NetAUC)，然后以NetAUC值為縱坐標(biāo)，以TroloX溶液濃度為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)曲。

AUC=0.5×[2×(Ao+A₁+…+A_n+1+A_n)-A_o-A₁]×△t

NetAUC=AUC_sample-AUC_blank

⑥吸取樣品液，按上述方法測(cè)定和計(jì)算單樅茶酒ORAC值。

二、結(jié)果與分析

1、單樅茶酒中兒茶素和GA測(cè)定結(jié)果

表2為兒茶素和GA標(biāo)品的標(biāo)曲方程。由決定系數(shù)R²可知方程均擬合良好。

圖1為單樅茶酒中兒茶素和GA的HPLC分析圖譜，表3為計(jì)算出的單樅茶酒中的兒茶素和GA含量。
 

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