L-賴氨酸是人類和動(dòng)物所必需八大氨基酸之一。在醫(yī)療方面應(yīng)用非常廣泛，比如防治骨質(zhì)疏松癥，提高機(jī)體的免疫功能和對傳染病的抗病能力，又如賴谷復(fù)合鹽用于治療慢性腦組織缺血、顱腦外傷病及缺氧性疾病的腦保護(hù)，還可以用于治療單純皰疹病毒和帶狀皰疹引起的唇皰疹等。近年來，90%以上的L-賴氨酸產(chǎn)品用于飼料添加劑，各大生產(chǎn)企業(yè)相繼擴(kuò)能投產(chǎn)，行業(yè)競爭慘烈。如何提高賴氨酸發(fā)酵糖酸轉(zhuǎn)化率、降低設(shè)備腐蝕，是降低生產(chǎn)成本提高企業(yè)競爭力的關(guān)鍵點(diǎn)。

甜菜堿作為發(fā)酵促進(jìn)劑在氨基酸發(fā)酵中應(yīng)用的研究很多，總結(jié)其主要功能包括兩點(diǎn)：1)維持和調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓。當(dāng)外界滲透壓發(fā)生劇烈變化時(shí)，細(xì)胞吸收或合成的甜菜堿通過穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、提高鉀鈉泵功能和阻止胞內(nèi)水分丟失等方式增加細(xì)胞對滲透壓的抗性。黃登高等在研究乳酸發(fā)酵時(shí)發(fā)現(xiàn)，甜菜堿能夠提高高糖濃度下乳酸菌的細(xì)胞生長速率和乳酸脫氫酶的活力，進(jìn)而提高乳酸產(chǎn)量。2)參與甲基化反應(yīng)。常立群等發(fā)現(xiàn)在谷氨酸發(fā)酵中添加適量甜菜堿可提高谷氨酸產(chǎn)酸。劉麗君在L-異亮氨酸產(chǎn)生菌的選育及發(fā)酵條件研究中介紹到，通過添加甜菜堿2.5g/L使得蘇氨酸發(fā)酵周期縮短12h，L-異亮氨酸產(chǎn)量提高66.3%。趙琳琳在脫氮假單胞菌產(chǎn)VB12發(fā)酵過程中甜菜堿作用機(jī)理及其補(bǔ)料策略的研究中介紹了甜菜堿在發(fā)酵過程中作用機(jī)理，甲基參與合成甲硫氨酸、VB12和丙氨酸等多種物質(zhì)，并指出甜菜堿分子中含有3個(gè)甲基，是高效的甲基供體，還得出甜菜堿質(zhì)量濃度在2～3g/L時(shí)菌濃增加了10.5%，VB12產(chǎn)量增加了23.8%的結(jié)論。

磷酸甜菜堿是甜菜堿的磷酸鹽，在賴氨酸發(fā)酵中應(yīng)用研究較少。目前，大多數(shù)企業(yè)在賴氨酸發(fā)酵配方中添加一定量的氯化膽堿起到調(diào)節(jié)滲透壓、提供甲基化反應(yīng)的甲基的作用，但氯化膽堿中氯離子對設(shè)備腐蝕性嚴(yán)重。“中國飼料行業(yè)信息網(wǎng)”報(bào)道，市場上質(zhì)量分?jǐn)?shù)為21%的氯化膽堿價(jià)格逐年上漲，2016年均價(jià)5400元/噸，2017年漲至6319.5元/噸，2018年漲至15000元/噸，已經(jīng)造成賴氨酸發(fā)酵成本上升10元/噸理論酸，而磷酸甜菜堿市場價(jià)格2016年為9600元/噸、2017年8952元/噸、2018年13500元/噸。相比之下磷酸甜菜堿價(jià)格上漲幅度較小。因此，筆者繼續(xù)實(shí)驗(yàn)了磷酸甜菜堿替代氯化膽堿在賴氨酸發(fā)酵中的應(yīng)用，可為提高賴氨酸發(fā)酵指標(biāo)、降低生產(chǎn)成本提供方向。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種

伊品生物科技股份有限公司菌種中心提供賴氨酸生產(chǎn)用菌。

1.1.2實(shí)驗(yàn)配方

三級(jí)種子基礎(chǔ)配方：MnSO₄質(zhì)量2kg，F(xiàn)eSO₄質(zhì)量2kg，KH₂PO₄質(zhì)量60kg，K₂HPO₄質(zhì)量60kg，(NH4)₂SO₄質(zhì)量250kg，MgSO₄質(zhì)量30kg，玉米漿體積2.0m3，消泡油質(zhì)量6kg，銅鋅質(zhì)量適量，定容體積35m³。

發(fā)酵底料基礎(chǔ)配方：MnSO4質(zhì)量25kg，F(xiàn)eSO₄質(zhì)量25kg，KH₂PO₄質(zhì)量160kg，K₂HPO₄質(zhì)量160kg，H₃PO₄質(zhì)量100kg，(NH4)₂SO₄質(zhì)量800kg，MgSO₄質(zhì)量250kg，玉米漿體積5.0m3，消泡油質(zhì)量200kg，銅鋅質(zhì)量適量，定容體積240m³。

總氮基礎(chǔ)配方：MnSO₄質(zhì)量20kg，F(xiàn)eSO₄質(zhì)量20kg，KH₂PO₄質(zhì)量250kg，K₂HPO₄質(zhì)量250kg，MgSO₄質(zhì)量500kg，消泡油質(zhì)量100kg，定容體積30m³。

1.1.3實(shí)驗(yàn)設(shè)備

體積為2500L的二級(jí)種子培養(yǎng)罐，5000L的三級(jí)種子培養(yǎng)罐，47000L的發(fā)酵罐，20000L配料罐，三級(jí)種子連消系統(tǒng)，底料連消系統(tǒng)，濃糖連消系統(tǒng)，硫銨連消系統(tǒng)，濃糖流加罐，硫銨流加罐，720型紫外分光光度計(jì)，100mL容量瓶，0～1000mL移液槍，1mL移液管，吸耳球，洗瓶等。

1.2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在現(xiàn)有三級(jí)種子基礎(chǔ)配方上分別用質(zhì)量濃度0.3，0.5，0.7，0.9g/L的磷酸甜菜堿替代氯化膽堿，定容30m³，接種量體積為1500L，OD為0.5的二級(jí)種子液，培養(yǎng)溫度30℃，PH實(shí)測6.95，溶氧控制>30%，初糖流加量均不變，在成熟凈OD均為0.45的情況下對比成熟周期，確定成熟周期最短時(shí)磷酸甜菜堿的用量即為最佳用量。

在現(xiàn)有發(fā)酵底料基礎(chǔ)配方、定容體積、接種量、培養(yǎng)溫度(37℃)、PH實(shí)測7.0、溶氧控制>30%、初糖質(zhì)量濃度0.02g/L、發(fā)酵過程殘?zhí)琴|(zhì)量濃度控制6.0g/L、NH⁺₄質(zhì)量濃度控制2.0～4.0g/L，其他因素均不變的情況下，設(shè)計(jì)用磷酸甜菜堿替代氯化膽堿的單因素多水平實(shí)驗(yàn)，添加質(zhì)量濃度分別為0.3，0.5，0.7，0.9g/L。對比因變量OD峰值、峰值周期、產(chǎn)酸質(zhì)量濃度、轉(zhuǎn)化率，最終確定磷酸甜菜堿在賴氨酸發(fā)酵底料中最佳用量。

在現(xiàn)有總氮配方基礎(chǔ)上添加磷酸甜菜堿，設(shè)計(jì)起始流加時(shí)間、總氮中磷酸甜菜堿添加濃度、糖氮比(濃糖與總氮的流加體積比)的三因素多水平正交實(shí)驗(yàn)，對比轉(zhuǎn)化率得出最佳添加質(zhì)量濃度、流加起始時(shí)間和糖氮體積比。

1.3分析測定方法

1.3.1OD值檢測方法

取1mL發(fā)酵液，用100mL容量瓶稀釋100倍，使用720型分光光度計(jì)在600nm波長下檢測OD值。

1.3.2發(fā)酵液中賴氨酸質(zhì)量濃度的測定

賴氨酸質(zhì)量濃度采用茚三酮顯色法測定。

步驟1用賴氨酸標(biāo)樣配置質(zhì)量濃度為10g/L賴氨酸鹽酸鹽標(biāo)液，分別取2，3，4，5，6mL賴氨酸鹽酸鹽標(biāo)液至100mL容量瓶中，用去離子水定容至100mL，得到質(zhì)量濃度分別為0.2，0.3，0.4，0.5，0.6g/L的賴氨酸鹽酸鹽標(biāo)樣。

步驟2發(fā)酵液稀釋150～500倍數(shù)，用離心機(jī)3500r/min離心10min，得到樣品上清液。

步驟3用1支10mL試管，取pH1.3的茚三酮溶液1mL，加入樣品離心上清液1mL，再用5支10mL試管，各取PH1.3的茚三酮溶液1mL，分別加入質(zhì)量濃度為0.2，0.3，0.4，0.5，0.6g/L的賴氨酸鹽酸鹽標(biāo)樣1mL，搖勻后在沸水浴中加熱10min，取出冷卻至室溫，在以上6支試管中繼續(xù)各加8mL去離子水，搖勻后用720型分光光度計(jì)在475nm波長下檢測吸光值。

步驟4在Excel中以賴氨酸鹽酸鹽標(biāo)樣質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，吸光值為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線公式，再將樣品吸光值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線公式中計(jì)算出發(fā)酵液中賴氨酸質(zhì)量濃度。賴氨酸發(fā)酵糖酸轉(zhuǎn)化率計(jì)算公式為

糖酸轉(zhuǎn)化率=(產(chǎn)量/加糖量)×100%

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

1)采用SAS隨機(jī)區(qū)組分析法分析磷酸甜菜堿對三級(jí)種子活力影響。

2)采用SPSS軟件設(shè)計(jì)影響磷酸甜菜堿流加因素的正交實(shí)驗(yàn)，并對實(shí)驗(yàn)結(jié)果做方差分析，確定最佳流加條件。

統(tǒng)計(jì)方法分析結(jié)果中的F表示自變量對因變量的影響大??；p表示自變量對因變量影響大小的顯著度，當(dāng)p>0.05時(shí)表示影響不顯著或無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，當(dāng)0.01<p<0.05時(shí)表示影響顯著，當(dāng)p<0.01時(shí)表示影響極其顯著。

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