6、AFB₁最優(yōu)降解條件的確定

由表4可知，二次回歸方程的模型極顯著，且方程的回歸系數(shù)R²為0.8992，因此方程的擬合度高，能夠正確反映AFB₁降解率與孵育時(shí)間、孵育溫度和酶活力之間的關(guān)系，通過DesignExpertv8.0.6軟件分析AFB₁最大降解率對(duì)應(yīng)的反應(yīng)條件為孵育時(shí)間15.030h、孵育溫度33.985℃、酶活力2.107U，預(yù)測(cè)值為91.866%，考慮實(shí)際操作，對(duì)應(yīng)的孵育時(shí)間15h、孵育溫度34℃、酶活力2U，得到的AFB₁降解率為91.08%，表明AFB₁降解率與預(yù)測(cè)值基本吻合，說明該模型可以預(yù)測(cè)AFB₁最大降解率。

7、AFB₁降解產(chǎn)物的總離子流色譜

如圖7所示，AFB₁經(jīng)漆酶降解后檢測(cè)到4個(gè)新的色譜峰，由峰形和分離度可看出，各產(chǎn)物分離效果較好，且由保留時(shí)間不同推測(cè)降解產(chǎn)物不同。根據(jù)AFB₁和降解產(chǎn)物的保留時(shí)間判斷5種物質(zhì)的極性大小為A＞B＞C＞AFB₁＞D。

8、AFB₁降解產(chǎn)物的分子式及結(jié)構(gòu)分析

為進(jìn)一步確定4種降解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)式，利用Q-TOF-MS進(jìn)行分析。在整個(gè)反應(yīng)體系中，AFB₁只含C、H、O3種元素，酶的本質(zhì)為蛋白質(zhì)，利用酶降解則可能引入N元素。利用采集到的各降解產(chǎn)物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，分析預(yù)測(cè)各產(chǎn)物可能的元素組成和分子式，如表5所示。

AFB₁主要由4個(gè)不同的降解作用位點(diǎn):1）香豆素內(nèi)酯環(huán)不穩(wěn)定，在外界條件下會(huì)脫羰基）能與核酸、蛋白質(zhì)等結(jié)合的呋喃環(huán)雙鍵和H₂O、H等發(fā)生加成反應(yīng)。3）環(huán)戊烯酮環(huán)通過加成反應(yīng)、取代反應(yīng)影響AFB1的毒性。4）苯環(huán)上的-0CH₃可以與-OH、H、-CHO發(fā)生取代反應(yīng)。同時(shí)，AFB₁的部分降解產(chǎn)物之間可以相互轉(zhuǎn)化。如圖8A所示，降解產(chǎn)物A在碰撞中產(chǎn)生[M+H]⁺為m/z279.0932的前體離子，根據(jù)高分辨質(zhì)譜結(jié)果擬合的分子式為C₁₆H₂₂O₄，同時(shí)產(chǎn)生[M+H]⁺為m/z201.0465、149.0236、121.0311的特征碎片離子。根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜特征離子m/z149，并利用Scifinder和Reaxy數(shù)據(jù)庫(kù)檢索。由降解產(chǎn)物A的特征碎片離子[M+H]⁺為m/z149.0236推測(cè)的結(jié)構(gòu)與Samuel等解析出的Pseudomonasputida降解AFB₁得到的AFD3產(chǎn)物結(jié)構(gòu)一致，并且經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該物質(zhì)對(duì)Hela細(xì)胞的毒性遠(yuǎn)小于AFB₁。如圖8B所示，降解產(chǎn)物B在碰撞中產(chǎn)生[M+H]⁺為m/z245.1282的前體離子，根據(jù)高分辨質(zhì)譜結(jié)果擬合的分子式為C₁₄H₁₆N₂O₂，同時(shí)產(chǎn)生[M+H]⁺為m/z217.1332、120.0811、154.0735、70.0680的特征碎片離子。根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜特征離子m/z271，推測(cè)該化合物結(jié)構(gòu)中存在一個(gè)羰基，并利用Scifinder和Reaxy數(shù)據(jù)庫(kù)檢索。如圖8C所示，降解產(chǎn)物A在碰撞中產(chǎn)生[M+H]⁺為m/z197.1145的前體離子，根據(jù)高分辨質(zhì)譜結(jié)果擬合的分子式為C₇H₁₂N₆O₁同時(shí)產(chǎn)生[M+H]⁺為m/z70.0678的特征碎片離子。根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜特征離子，推測(cè)該化合物中有吡咯烷結(jié)構(gòu)，并利用Scifinder和Reaxy數(shù)據(jù)庫(kù)檢索。如圖8D所示，降解產(chǎn)物C在碰撞中產(chǎn)生[M+H]⁺為m/z415.2427的前體離子，根據(jù)高分辨質(zhì)譜結(jié)果擬合的分子式為C₂₄H₃₀O₆，同時(shí)產(chǎn)生[M+H]⁺為m/z397.1455、109.0863的特征碎片離子。根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜特征離子m/z397和m/z109，推測(cè)該化合物結(jié)構(gòu)中存在一個(gè)羥基和苯甲醇結(jié)構(gòu)單元，并利用Scifinder和Reaxy數(shù)據(jù)庫(kù)檢索。AFB₁經(jīng)漆酶降解后的各產(chǎn)物結(jié)構(gòu)見圖9。

有研究表明連續(xù)損失-CO是AFB₁的主要的碎裂途徑，苯環(huán)上的甲氧基也會(huì)發(fā)生甲苯和甲醇丟失。根據(jù)降解方式的不同，AFB₁可發(fā)生羥基化、環(huán)氧化、還原和脫氫等反應(yīng)。AFB₁的微生物降解主要涉及毒素呋喃環(huán)或香豆素內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)的修飾，這2種結(jié)構(gòu)是AFB₁具有高致癌性和高毒性的主要原因。WangJianqiao等首次報(bào)道錳過氧化物酶可以通過將AFB₁轉(zhuǎn)化為AFB₁-8，9-二氫二醇而有效去除AFB₁的誘變活性。LiJianlong等利用耐鹽CandidaversatilisCGMCC3790降解AFB₁得到4種降解產(chǎn)物，推測(cè)AFB₁有2種降解途徑，一種是內(nèi)酯環(huán)和苯環(huán)被水解，另一種是通過加氫破壞內(nèi)酯環(huán)的酯鍵和醚鍵。Samuel等19發(fā)現(xiàn)AFB₁的呋喃環(huán)、內(nèi)酯羰基和環(huán)戊烯酮環(huán)被Pseudomonasputida修飾、破壞而轉(zhuǎn)化成不同結(jié)構(gòu)的化合物。

Afsharmanesh等22發(fā)現(xiàn)F₄₂₀H₂還原酶可以催化α-和β-不飽和酯部分的雙鍵還原，BacC氧化還原酶可以催化香豆素內(nèi)酯環(huán)雙鍵水解產(chǎn)生羧酸，隨后發(fā)生脫羧基反應(yīng)生成產(chǎn)物。

酶降解體系復(fù)雜，漆酶在整個(gè)體系中發(fā)揮催化作用，裂解成包含-NH2、R-NH2等官能團(tuán)的小分子多肽、氨基酸等化合物，可以與AFB₁的活性位點(diǎn)發(fā)生加成、取代等一系列反應(yīng)，因此AFB₁的降解路徑較為復(fù)雜。本實(shí)驗(yàn)得到的4種降解產(chǎn)物均不含呋喃環(huán)雙鍵、香豆素內(nèi)酯環(huán)和環(huán)戊酮烯環(huán)，且所含雙鍵數(shù)量均小于AFB₁可能在AFB₁分子的上述毒性部位通過加成、取代或氧化反應(yīng)產(chǎn)生了新的支鏈。降解產(chǎn)物A（C₁₆H₂₂O₄）比AFB₁少一個(gè)-CO₂，多10個(gè)H，推測(cè)可能為AFB₁丟失-CO后發(fā)生脫羰基反應(yīng)，結(jié)構(gòu)中的雙鍵與H原子發(fā)生加成。降解產(chǎn)物B（C₇H₁₂N₆O）和C（C₁₄H₁₆N₂O₂）均含有N元素，可能是體系中的含N小分子化合物參與反應(yīng)，且發(fā)現(xiàn)相近的裂解碎片，推測(cè)可能為AFB1發(fā)生連續(xù)的-CO丟失后，與H₂O和-NH₂發(fā)生加成和取代反應(yīng)，生成產(chǎn)物C和D。推測(cè)降解產(chǎn)物D（C₂₄H₃₀O₆）的生成途徑為呋喃環(huán)雙鍵發(fā)生加成反應(yīng)而斷裂，連續(xù)丟失-CO，雙鍵與H₂O和H發(fā)生加成反應(yīng)。

AFs的毒性和致癌機(jī)制已經(jīng)被廣泛研究，主要與二氫呋喃環(huán)和香豆素結(jié)構(gòu)有關(guān)，通過對(duì)本研究降解產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的分析，發(fā)現(xiàn)呋喃環(huán)雙鍵和香豆素內(nèi)酯環(huán)均被破壞，因此推測(cè)漆酶降解AFB₁得到的產(chǎn)物毒性顯著低于親本毒素。也有研究表明AFB₁經(jīng)漆酶處理后，呋喃環(huán)雙鍵或內(nèi)酯環(huán)裂解，產(chǎn)物的熒光性和誘變性減弱，且未檢測(cè)到與AFB₁相近的結(jié)構(gòu)類似物。但是由于漆酶的來源、降解條件存在差異性，也可能造成降價(jià)產(chǎn)物的毒性存在差異，需要進(jìn)行體外細(xì)胞毒性、遺傳毒性實(shí)驗(yàn)以及體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證，評(píng)估降解產(chǎn)物的安全性。

本研究選擇與栓菌漆酶lac3基因同源性最高的3KW7作為模板進(jìn)行同源模建，將AFB₁對(duì)接到漆酶的活性部位，結(jié)果顯示漆酶與AFB₁可以相互作用，氫鍵是關(guān)鍵作用力，表明漆酶可用于AFs的降解。通過實(shí)際的降解實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，響應(yīng)面優(yōu)化獲得AFB₁降解率最優(yōu)的條件為應(yīng)時(shí)間15h，孵育溫度34℃，酶活力2U，降解率可達(dá)91.08%。在此條件下利用UPLC-Q-TOF-MS分析AFB₁降解產(chǎn)物結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)4個(gè)主要降解產(chǎn)物，根據(jù)其二級(jí)質(zhì)譜信息和精確分子質(zhì)量，推測(cè)出降解產(chǎn)物的分子式分別為C₁₆H₂₂O₄、C₁₄H₁₆N₂O₂、C₇H₁₂N₆O和C₂₄H₃₀O₆。

本實(shí)驗(yàn)只針對(duì)最優(yōu)降解條件下產(chǎn)物的生成途徑及結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，對(duì)于不同降解條件下產(chǎn)物的差異性未進(jìn)行探討，蛋白酶的來源及作用時(shí)間、溫度和酶活力等外界因素可能會(huì)影響降解途徑及產(chǎn)物結(jié)構(gòu)，需進(jìn)一步進(jìn)行分析研究。國(guó)外對(duì)黃曲霉生物脫除的研究較多集中在乳酸菌、放線菌和一些真菌中如樹狀指孢霉（Dactyliumdendroide）、寄生曲霉（Aspergillusparasiticus）、糙皮側(cè)耳（Pleurotusostreatus）、莖點(diǎn)霉（Phomasp）、白腐菌變色栓菌（Trametesversicolor）等。對(duì)乳酸菌的研究多數(shù)認(rèn)為乳酸菌降解AFB₁是通過生物吸附作用，Eshelli等研究了放線菌對(duì)AFB₁降解推斷其降解途徑可能和脂肪酸及糖酵解中間產(chǎn)物的累積有關(guān)，而對(duì)真菌的研究表明其對(duì)AFB₁的降解多數(shù)為生物降解，主要通過微生物分泌蛋白酶的酶促反應(yīng)；如左振宇、楊文華等分別從真菌假蜜環(huán)菌（Armillariellatabescens）、黏細(xì)菌（Myxococcusfulvus）、施氏假單胞菌（Pseudomonasstutzeri）F4中得到了能降解AFs的蛋白酶，前兩者還嘗試了其在大腸桿菌和畢赤酵母中進(jìn)行表達(dá)，并進(jìn)行一些酶學(xué)基本性質(zhì)的分析?？偟膩碚f，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)能使AFs含量降低包括細(xì)菌、真菌和酵母菌在內(nèi)的大約有上千種微生物，但是多數(shù)的研究主要側(cè)重在AFs降解菌株的篩選和粗提液降解能力的分析上，對(duì)于不同微生物來源的蛋白酶的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和底物作用模式、降解機(jī)理、產(chǎn)物結(jié)構(gòu)及降解產(chǎn)物毒性的認(rèn)識(shí)仍缺乏深入的研究與探討。這可能與微生物產(chǎn)酶量低，分離純化困難，酶性質(zhì)不穩(wěn)定及作用條件苛刻等原因有關(guān)。但隨著生物化學(xué)、分子生物學(xué)、基因工程及酶工程等技術(shù)的發(fā)展成熟，人們對(duì)酶的認(rèn)識(shí)越來越清晰，重組載體構(gòu)建、異源表達(dá)、電子自旋共振、同源模建、分子模擬、晶體結(jié)構(gòu)解析等手段的建立使上述研究過程中的瓶頸可能得以突破，有更多的手段和方法解析問題背后的本質(zhì)。
 

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