馬鈴薯粉痂病（Potato powdery scab）是由粉痂菌（Spongospora subterranea f. sp. subterrane）引起的真菌性病害，主要危害根部和塊莖，也可使莖染病。粉痂菌以休眠孢子囊球隨種薯或病殘?bào)w越冬。病薯和土壤中病殘?bào)w為病害的初侵染源，遠(yuǎn)距離傳播主要依靠種薯，田間傳播主要通過(guò)澆水、病土、病肥等。馬鈴薯粉痂病能使馬鈴薯產(chǎn)量減少10%～20%，重者可達(dá)到 50%。

我國(guó)內(nèi)蒙古、廣東、貴州、江西、浙江、云南、吉林、甘肅、福建等地均有馬鈴薯粉痂病的發(fā)生，國(guó)外許多國(guó)家和地區(qū)，如以色列、美國(guó)、巴基斯坦、哥斯達(dá)黎加、韓國(guó)、意大利等均有報(bào)道。由于粉痂菌不能人工培養(yǎng)，國(guó)內(nèi)對(duì)馬鈴薯粉痂菌檢測(cè)的研究較少，其防治藥劑效果也較差，因此，針對(duì)馬鈴薯粉痂菌，亟需建立快速、靈敏、準(zhǔn)確性高的檢測(cè)方法，為該病害的早期監(jiān)測(cè)和預(yù)防提供重
要依據(jù)。

已報(bào)道的土壤帶菌量的檢測(cè)方法有誘餌法、ELISA 法和 PCR 檢測(cè)。Hui 等以番茄幼苗作為誘餌，檢測(cè)到馬鈴薯重茬 0～10 cm 土壤中的馬鈴薯粉痂病菌。但是番茄幼苗誘餌法只能檢測(cè)到土壤中粉痂病菌活的游動(dòng)孢子，無(wú)法檢測(cè)到休眠孢子且檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)、操作繁瑣。Liu 等利用棉花黃萎病的病原菌菌絲蛋白作為抗原，制備該病原菌菌絲蛋白的多克隆抗體，建立特異性檢測(cè)棉花黃萎病菌的間接 ELISA 方法，但由于真菌結(jié)構(gòu)與物質(zhì)組成復(fù)雜,尋找特異性抗原有很大難度；近年來(lái)，由于 PCR 技術(shù)更加快速、準(zhǔn)確、便捷而被廣泛應(yīng)用于病原菌的檢測(cè)和定量研究。Guo 等[21]通過(guò)篩選不同瘡痂菌的通用探針，建立了馬鈴薯瘡痂菌的快速 PCR 檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)病組織和土壤樣品的快速檢測(cè)；Nian 等通過(guò)建立實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 體系從而快速準(zhǔn)確鑒定了小麥黑穗菌（Tilletia controversa Kühn），應(yīng)用于小麥矮腥黑穗病的早期診斷。

Graff 等根據(jù)馬鈴薯粉痂菌內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)設(shè)計(jì)了一對(duì)大小為 61 bp 的特異性引物 SsTQF1/SsTQR1 和一個(gè)熒光 Taqman®探針 SsTQP1，可以檢測(cè)和定量懸浮在水中或與粘土混合的休眠孢子堆。Qu 等[24]根據(jù)馬鈴薯粉痂菌內(nèi)部轉(zhuǎn)錄設(shè)計(jì)了大小為 434 bp SSF/SSR 引物，該研究成功地應(yīng)用于有無(wú)粉痂病癥狀的帶菌馬鈴薯塊莖的檢測(cè)，可以檢測(cè)到1/g土的孢子球。鑒于目前缺乏對(duì)馬鈴薯粉痂菌快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，本研究基于馬鈴薯粉痂菌內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)和線粒體 DNA，分別設(shè)計(jì)了適用于初步檢測(cè)的普通PCR 特異性引物和實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 特異性引物，建立了快速、高靈敏性的檢測(cè)體系。針對(duì)在生產(chǎn)中馬鈴薯粉痂病危害嚴(yán)重，缺乏病原菌快速檢測(cè)的方法的情況。本研究通過(guò)篩選特異性好、穩(wěn)定性高的粉痂菌特異性引物，建立馬鈴薯粉痂病快速檢測(cè)體系，以期為馬鈴薯粉痂病的早期預(yù)警提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

試驗(yàn)所用的粉痂菌（S. subterranea）、灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）、葫蘆科刺盤孢菌（Colletotrichum lagenarium）、尖孢鐮孢菌（Fusarium oxysporum）、大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）、核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）、茄匍柄霉菌（Stemphylium solani）、疫霉菌（Phytophthora infestans）、多主棒孢菌（Corynespora cassiicola）、細(xì)極鏈格孢菌（Alternaria tenuissima）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、瘡痂鏈霉菌（Streptomyces scabies）均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所分離保存（表 1）。

1.2 DNA 提取

馬鈴薯粉痂病斑或培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)一周的菌絲體，采用植物基因組 DNA 提取試劑盒提取植物基因組或病原菌基因組 DNA?；煊行菝哝咦幽业木梁吞镩g土壤總 DNA 提取采用 TIANamp Soil DNA Kit 土壤基因組 DNA 提取試劑盒提取土壤總 DNA。NanoDrop 2000定量 DNA 濃度，保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù) NCBI GenBank 中已登記的馬鈴薯粉痂菌及其他非靶標(biāo)菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株基因序列（表2），利用DNAMAN 8.0 軟件比對(duì)，選取粉痂菌內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)和線粒體 DNA 的保守區(qū)域，設(shè)計(jì)了兩對(duì)應(yīng)用于普通 PCR 的特異性引物 A5: 5'-ACAACTCTTAACAGTGG-3'，A9: 5'-AATGGTTAGAGACGAATC-3'，C3: 5'-AATCTAGAGCACCCCGTTTTCATTCG-3'，C8: 5'-TGCGCAAACCTTAATACGGGAA-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為 281 和 391bp；和一對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 的特異性引物 QF: 5'-GCAACTAAATAAAATTTAATGCTAAAAGTG-3'，QR:5'-TTTGTACGCTAAGTTCGATAGGAG-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為 104 bp（圖 1）。引物均由北京博邁德基因公司合成。

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