隨著人們對自由基生命研究的不斷關注，氧化應激損傷和抗氧化保護作用的研究成為熱點。因人體中抗氧化的物質(zhì)有限當氧化劑與人體內(nèi)抗氧化劑失去平衡時，人體會處于氧化應激狀態(tài)。當體內(nèi)的氧化劑濃度超過細胞防御能力時，氧化損傷可引起如癌癥，多發(fā)性硬化癥和心血管疾病等疾病。目前最常見的是化學抗氧化劑，但因其有一定的毒副作用所以使用受到限制。近年來研究發(fā)現(xiàn)，由蛋白酶水解制得的生物活性肽具有一定的抗氧化能力，水解出的抗氧化肽與大分子蛋白質(zhì)相比，顯具有更高的生物活性，抗氧化肽在體內(nèi)積累具有清除自由基和抑制脂質(zhì)過氧化的功能，能夠維持機體內(nèi)自由基的平衡，從而提高機體抗衰老和抗疾病的能力?？寡趸囊蚱渚哂邪踩⒏咝?、易吸收等特點，在保健、醫(yī)療等領域受到了管飯的重視。

綠豆又名青小豆，屬于醫(yī)食兩用作物，是我國主要的糧食作物之一，在全國多地區(qū)種植，年均產(chǎn)量在6l萬噸且富含高質(zhì)量的植物蛋白，是優(yōu)質(zhì)的食品加工原料。食用綠豆益處繁多，如可以降低血脂、提高機體免疫力、預防衰老以及具有抗氧化等作用。綠豆多肽中的抗氧化活性肽相對分子質(zhì)量小，具有良好的水溶性、低黏度、穩(wěn)定性強，是天然的抗氧化劑，能夠起到清除體內(nèi)自由基、抑制生物大分子物質(zhì)過氧化的作用，具有延緩衰老、預防疾病等優(yōu)點，有很高的利用價值。但就目前而言，綠豆抗氧化多肽的制備工藝研究較少，不能滿足現(xiàn)階段的需求，生產(chǎn)成本較高，制備工藝不太成熟，對于綠豆多肽提取的研究有著重要意義。

一、材料與方法

1、材料及試劑

綠豆蛋白：實驗室自制；鹽酸：中國醫(yī)藥上?；瘜W試劑公司；堿性蛋白酶(6000U/g)：Sigma試劑公司；氫氧化鈉、DPPH、無水乙醇：以上均為分析純，均購自天津市科密歐試劑有限公司。

2、主要儀器設備

紫外可見分光光度儀：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；精密pH計：梅特勒托利多儀器(上海)有限公司；恒溫干燥箱：湘儀離心機儀器有限公司；電子天平(RSJ200—4)：湘儀離心機儀器有限公司；離心機(TDZ5一WS)：湘儀離心機儀器有限公司。

3、實驗方法

（1）綠豆抗氧化肽的制備

將綠豆蛋白配置成一定濃度的溶液，水浴加熱至100℃進行15min均質(zhì)處理。待溶液冷卻至酶解最適溫度，水浴保溫，向溶液中加入0.5mol／L的NaOH調(diào)節(jié)其pH，酶解一段時間后100℃水浴滅活10min，室溫下離心(4000r／min，20min)，將上清液凍干后保存。

（2）DPPH自由基清除能力的測定

參照于慧等人的方法進行DPPH自由基清除率的測定。將2mL一定濃度的綠豆多肽溶液和2mL的0.12mm01·L^-1DPPH溶液進行混合，避光于25℃條件下反應30min，取出后于517nm波長下進行吸光值的測定，此時吸光度值記錄為A_i；將上述過程中的2mLDPPH溶液用無水乙醇取代，然后與2mL綠豆多肽溶液進行反應，此條件下測定吸光值記錄為A_j，將2mL無水乙醇與2mLDPPH溶液反應的條件作為空白組，此時記錄吸光值為Ao。
DPPH清除率計算公式如下：

A_i：樣品組吸光度值；

A_j：對照組吸光度值；

A₀：空白組吸光度值。

（3）單因素實驗

本實驗在于研究酶法對綠豆蛋白水解的抗氧化肽的工藝優(yōu)化，故以DPPH為指標，選擇酶解時間、酶解溫度、酶添加量以及pH為因素進行單因素實驗。

①酶解溫度對綠豆多肽抗氧化性的影響

將底物濃度為4％、pH為9、酶解時間3h作為固定條件，測定當酶解溫度分別為30℃、40℃、50℃、60℃、70℃五個條件下時的DPPH清除率。

②酶濃度對綠豆多肽抗氧化性的影響

將pH為9、酶解溫度50℃、酶解時間3h作為固定條件，測定當酶濃度分別為2％、4％、6％、8％、10％五個條件下時的DPPH清除率。

③pH對綠豆多肽抗氧化性的影響

將底物濃度為4％、酶解溫度50℃、酶解時間3h作為固定條件，測定當pH分別為7、8、9、10、11五個條件下時的DPPH清除率。

④酶解時間對綠豆多肽抗氧化性的影響

將底物濃度為4％、pH為9、酶解溫度50℃作為固定條件，測定當酶解時間分別為0.5h、lh、2h、3h、4h五個條件下時的DPPH清除率。

（4）響應面優(yōu)化設計

通過單因素實驗的結果，可以篩選出各因素的三個水平。所以在此基礎之上，應用統(tǒng)計分析軟件建立4因素3水平的Box—Behnken模型，進行回應面優(yōu)化設計。因素和水平取值如表1所示。

二、結果與討論

1、單因素實驗結果

（1）綠豆多肽抗氧化性與酶解溫度的關系

將綠豆蛋白配置成一定濃度的溶液，水浴加熱至100℃進行15min均質(zhì)處理。待溶液冷卻至酶解最適溫度，水浴保溫，向溶液中加入0.5mol／L的NaOH調(diào)節(jié)其pH，酶解一段時間后100℃水浴滅活10min，室溫下離心(4000r／min，20min)，將上清液凍干后保存。結果如圖1所示。

由圖1可知，當酶解溫度低于50℃，DPPH清除率與溫度成正比，當溫度超過50℃時，DPPH清除率開始下降。這是因為蛋白酶對穩(wěn)定的要求較高，溫度過低會影響酶解的反應速度，使酶解反應不徹底，從而影響抗氧化肽的抗氧化效果。而溫度過高則會影響蛋白酶的活性，使蛋白酶的活性降低，無法使蛋白水解成具有抗氧化性的小分子肽段，從而使DPPH清除率降低。

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