2.2　反硝化作用

參與氮循環(huán)反硝化作用的功能基因包括了硝酸鹽還原酶（narG）、亞硝酸鹽還原酶（nirK/nirS）、一氧化氮還原酶（norB）、氧化亞氮還原酶（nosZ）等，分別負(fù)責(zé)催化NO₃-—NO₂-—NO—N₂O—N₂轉(zhuǎn)化。其中，nirK/nirS、nosZ是最常用于開展反硝化研究的主要分子標(biāo)記基因。通過PCRDGGE技術(shù)和熒光定量PCR技術(shù)的分析，堆肥中各個(gè)時(shí)期普遍存在nirK/nirS、nosZ，而研究nirK/nirS在堆肥中反硝化作用的相對(duì)貢獻(xiàn)率，既是影響溫室氣體N₂O排放的重要因素，也是理解堆肥中氮素轉(zhuǎn)化機(jī)制的關(guān)鍵問題。有研究者在堆肥中添加生物炭，發(fā)現(xiàn)nirK基因豐度受到抑制，并且N₂O的排放顯著減少。新近研究結(jié)果則更加明確了nirK/nirS的相對(duì)貢獻(xiàn)率，通過采用選擇性抑制劑以及同位素比率法測(cè)定了牛糞堆肥中細(xì)菌nirK/nirS、真菌nirK的反硝化活性，從而明確了在牛糞堆肥過程中，細(xì)菌nirK的反硝化活性是N₂O排放的關(guān)鍵功能酶，但參與編碼nirK的反硝化細(xì)菌種類繁多，仍然需要進(jìn)一步開展相關(guān)研究。而也有研究表明不同堆肥階段的narG，nirS和nosZ的基因表達(dá)與N₂排放顯著相關(guān)。因此，不同堆肥條件下，闡明參與反硝化作用的功能微生物群落結(jié)構(gòu)及其如何影響N₂O排放，與堆肥環(huán)境因子的作用機(jī)制等仍是有待的深入探索。

2.3　厭氧氨氧化作用

厭氧氨氧化（AnaerobicAmmoniumOxidation,Anammox）則是繼硝化、反硝化后被發(fā)現(xiàn)的由微生物介導(dǎo)的氮素轉(zhuǎn)化過程，由于厭氧氨氧化過程與反硝化過程對(duì)NO₂的競(jìng)爭(zhēng)作用會(huì)引起N₂O、N₂ 排放的差異，最終將影響堆肥過程的溫室氣體N₂O的排放。厭氧氨氧化細(xì)菌普遍存在于自然環(huán)境中，主要是在高氮、缺氧或好氧/缺氧的交界面環(huán)境條件中生存，在許多生態(tài)系統(tǒng)中是主要的氮損失途徑，不同生態(tài)系統(tǒng)中具有不同優(yōu)勢(shì)類群的厭氧氨氧化細(xì)菌，在堆肥體系中的研究則剛剛起步。

2.3.1厭氧氨氧化的關(guān)鍵酶基因分子標(biāo)記研究　

參與Anammox過程的微生物組成、關(guān)鍵酶基因、生態(tài)分布等基因組學(xué)信息被科學(xué)家逐步認(rèn)知，這主要依賴于分子標(biāo)記手段進(jìn)行研究。由于厭氧氨氧化細(xì)菌16SrRNA基因序列存在特異性不足的問題，研究者對(duì)參與Anammox過程關(guān)鍵功能酶及其編碼基因進(jìn)行深入研究，這包括亞硝酸鹽還原酶（Nir），聯(lián)氨合成酶（HZS）和聯(lián)氨氧化酶（HZO）及其編碼基因（包括了nirS、nirK、hzs、hzo基因）可更好地應(yīng)用于多樣性研究中。但不同功能基因在用于評(píng)估厭氧氨氧化細(xì)菌的多樣性和群落結(jié)構(gòu)的研究中實(shí)際效果仍有不同。采用這些功能基因的研究仍處于初步的階段，研究發(fā)現(xiàn)nirS基因并非存在于所有厭氧氨氧化細(xì)菌，部分厭氧氨氧化細(xì)菌只檢測(cè)到了nirK基因?，F(xiàn)有的研究結(jié)果顯示，nirS不適于單獨(dú)作為厭氧氨氧化細(xì)菌群落分析的特異性分子標(biāo)記，而應(yīng)用hzsA、hzsB、hzo基因獲得的分析結(jié)果與16SrRNA基因的研究結(jié)果具有較好的一致性，且hzs、hzo基因具有更高特異性。

2.3.2不同生境的厭氧氨氧化菌群結(jié)構(gòu)及其環(huán)境影響因子　

目前，對(duì)厭氧氨氧化過程的研究主要集中在不同類型生境的細(xì)菌群落演化，包括海洋、淡水、陸地生態(tài)系統(tǒng)等。研究發(fā)現(xiàn)，CandidatusScalindua屬通常在海洋生態(tài)系統(tǒng)的高鹽度環(huán)境中占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，河口生態(tài)系統(tǒng)中以Ca.Scalindua、Ca.Brocadia、Ca.Kuenenia為主，污水廠、反應(yīng)器等工程生態(tài)系統(tǒng)中以Ca.Brocadia、Ca.Kuenenia和Ca.Jettenia為主，農(nóng)田土壤中則以Ca.Brocadia、Ca.Kuenenia為主。鹽分、氮素養(yǎng)分、溫度、溶解氧等均是影響厭氧氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的重要環(huán)境因子。Ca.Scalindua適應(yīng)高鹽度的海洋環(huán)境主要是通過表達(dá)一種對(duì)NO^-₂、NH⁺₄具有高親和力的蛋白質(zhì)。而Ca.Brocadia通常生長于淡
水生態(tài)環(huán)境且傾向于在高濃度的NO^-₂、NH⁺₄環(huán)境中占據(jù)優(yōu)勢(shì)。針對(duì)海洋生態(tài)系統(tǒng)的研究發(fā)現(xiàn)，NH⁺₄、NH⁺₄/∑（NO^-₃+NO^-₂）與厭氧氨氧化細(xì)菌多樣性正相關(guān)，而有機(jī)質(zhì)含量則是負(fù)相關(guān)。

另外，厭氧氨氧化細(xì)菌可以在寬泛的溫度中生存，從高寒環(huán)境到深海熱液，群落結(jié)構(gòu)也會(huì)隨著溫度變化而發(fā)生演化。Ca.Kuenenia對(duì)溫度變化具有很好的適應(yīng)性，而Ca.Scalindua則能夠在80℃的環(huán)境中生存。

2.3.3好氧堆肥中厭氧氨氧化菌群研究　

在好氧堆肥過程中，由于存在著微環(huán)境局部厭氧條件，已有研究發(fā)現(xiàn)在牛糞堆肥過程中的檢測(cè)出厭氧氨氧化細(xì)菌，并研究了厭氧氨氧化細(xì)菌群落多樣性。研究者采用聚合酶鏈反應(yīng)-變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）技術(shù)對(duì)厭氧氨氧化細(xì)菌16SrRNA基因擴(kuò)進(jìn)行增，分析了牛糞堆肥過程中厭氧氨氧化細(xì)菌多樣性，結(jié)果顯示厭氧氨氧化細(xì)菌存在于整個(gè)堆肥過程，Ca.Brocadia、Ca.Kuenenia和Ca.Scalindua3個(gè)屬為優(yōu)勢(shì)菌屬，且多樣性隨著不同堆肥階段變化，高溫期和降溫期的多樣性較高；與其他生態(tài)系統(tǒng)的研究結(jié)果不同的是，在堆肥高溫期的優(yōu)勢(shì)菌屬是Ca.Brocadia。而針對(duì)不同堆肥原料的好堆肥過程中，厭氧氨氧化細(xì)菌多樣性是否具有一致性，群落結(jié)構(gòu)組成對(duì)堆肥環(huán)境條件異質(zhì)性的響應(yīng)，以及環(huán)境因子驅(qū)動(dòng)厭氧氨氧化的作用機(jī)制等內(nèi)容仍有待于進(jìn)一步的開展。

3　好氧堆肥過程的硫素轉(zhuǎn)化

在硫素代謝方面，堆肥中惡臭硫氣體的排放，盡管排放通量較低，但其嗅閾值遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于NH₃，成為限制堆肥技術(shù)發(fā)展的主要次生環(huán)境污染問題。硫素生物轉(zhuǎn)化過程（圖1）中，如硫化氫在好氧條件下可被硫氧化細(xì)菌氧化形成硫酸鹽，而在厭氧條件下硫酸鹽則被還原為H2S等惡臭硫氣硫氧化途徑，包括：（1）硫化物氧化途徑，黃素細(xì)胞色素c硫化氫脫氫酶（Fcc）、硫化物醌還原酶（Sqr）；（2）單質(zhì)硫氧化途徑，異化亞硫酸鹽還原酶（Dsr）、類異二硫醚還原酶（Hdr）；（3）硫氧化酶復(fù)合體（Sox）等。Luo等對(duì)硫氧化酶系統(tǒng)（soxB）、硫化物醌還原酶（sqr）、異化亞硫酸還原酶（dsrA）編碼基因的高通量測(cè)序分析，揭示了珠江流域中的硫氧化優(yōu)勢(shì)種群以及功能基因的多樣性，表明硫氧化細(xì)菌在水體硫生物化學(xué)循環(huán)
發(fā)揮著重要作用。在硫氧化細(xì)菌中，硝酸鹽還原硫氧化細(xì)菌（Nitrate-reducing,sulfide-oxidizingbacteria,NR-SOB）是一類將硝酸鹽還原與硫化物氧化同時(shí)催化進(jìn)行的細(xì)菌，NR-SOB的多樣性和分布特征是研究碳氮硫循環(huán)的重要菌群，可指導(dǎo)污水、黑臭水體、污泥治理等諸多氮硫轉(zhuǎn)化調(diào)控技術(shù)。

在好氧堆肥中的硫素轉(zhuǎn)化研究，主要集中在通過添加外源化合物、功能微生物調(diào)控堆肥過程，從而實(shí)現(xiàn)減少氮素?fù)p失和惡臭氣體排放。通過添加硫磺可以改善堆肥品質(zhì)，減少氮素?fù)p失。最初，在堆肥中添加具備酸性化學(xué)特性的單質(zhì)元素硫，有效降低了堆肥pH，更有利于堆肥產(chǎn)物的農(nóng)田應(yīng)用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在堆肥中添加硫磺和硫氧化細(xì)菌既降低堆肥pH，且顯著提高了堆肥中NH₄⁺、NO₃^-含量。由此可推測(cè)，堆肥中存在著氮硫相互作用，添加硫磺和硫氧化細(xì)菌不僅影響了堆肥pH，也影響了氮素轉(zhuǎn)化。利用硝酸鹽作為電子受體，對(duì)硫酸鹽還原起到競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用，在堆肥中添加硝酸鹽顯著降低惡臭硫氣體的產(chǎn)生。近年來，有學(xué)者通過添加外源七鉬酸銨和亞硝酸鹽到好氧堆肥中，有效降低惡臭硫氣體（二甲基硫、二甲基二硫）的排放量達(dá)92.3%和82.3%。目前，在好氧堆肥中的硫素轉(zhuǎn)化研究中，針對(duì)參與好氧堆肥過程中的硫素轉(zhuǎn)化的微生物多樣性以及群落結(jié)構(gòu)等研究較少，對(duì)參與堆肥惡臭硫氣體轉(zhuǎn)化的功能微生物及其動(dòng)態(tài)變化過程也知之甚少，仍有待于進(jìn)一步開展相關(guān)研究工作，以闡明其相關(guān)的作用機(jī)理。

4　展望

長期以來，畜禽糞污綜合利用率低、好氧堆肥處理效率低，其核心問題即是由微生物驅(qū)動(dòng)氮、硫物質(zhì)轉(zhuǎn)化過程所引起的氮素流失及臭氣排放。得益于高通量測(cè)序等現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，科學(xué)家可以深入的研究參與好氧堆肥過程的微生物群落特征以及功能微生物的分子機(jī)制。然而人們通常只針對(duì)某一類微生物、氮素或硫素單一的轉(zhuǎn)化過程開展獨(dú)立研究，如針對(duì)好氧堆肥工藝調(diào)控過程中的氮循環(huán)硝化、反硝化的功能微生物上的研究等。在現(xiàn)有的研究中，好氧堆肥微生物群落的動(dòng)態(tài)變化及其時(shí)空異質(zhì)性已取得初步的了解，這有助于我們?cè)黾訉?duì)不同堆肥階段發(fā)揮主要作用的優(yōu)勢(shì)菌群的認(rèn)知。同時(shí)，已有研究分析了厭氧氨氧化對(duì)局部生態(tài)系統(tǒng)中氮循環(huán)的貢獻(xiàn)率，但對(duì)于好氧堆肥中的厭氧氨氧化過程則知之甚少，僅有的研究證實(shí)了堆肥過程中存在厭氧氨氧化作用。在硫素轉(zhuǎn)化過程的研究中，也已證實(shí)了氮硫轉(zhuǎn)化的關(guān)聯(lián)性，但對(duì)堆肥過程中的氮硫相互作用機(jī)理則少有深入的研究，針對(duì)氮硫作用的研究主要集中在污水、黑臭水體、污泥治理等領(lǐng)域。

因此，在現(xiàn)有研究的基礎(chǔ)上，從不同堆肥物料的氮硫生物轉(zhuǎn)化過程出發(fā)，利用基因組學(xué)與理化分析相結(jié)合的技術(shù)手段，對(duì)畜禽糞污好氧堆肥工藝下的氮硫轉(zhuǎn)化動(dòng)態(tài)、氣體排放規(guī)律、生物化學(xué)機(jī)理等進(jìn)行深入研究，闡明相關(guān)功能微生物的群落特征及功能基因表達(dá)情況，既可以從微生物尺度提升對(duì)堆肥過程中物質(zhì)轉(zhuǎn)化規(guī)律的認(rèn)識(shí)，也有利于揭示整個(gè)堆肥過程中影響氮硫生物轉(zhuǎn)化的環(huán)境因子（圖1）。此外，可同時(shí)利用多組學(xué)、同位素標(biāo)記技術(shù)等驗(yàn)證各個(gè)氮硫生物轉(zhuǎn)化過程之間的耦合作用及相關(guān)功能微生物種群在物質(zhì)循環(huán)中的貢獻(xiàn)率，為提升畜禽糞污高效生物轉(zhuǎn)化技術(shù)工藝、惡臭氣體減排提供堅(jiān)實(shí)的科學(xué)基礎(chǔ)。

當(dāng)前我國正處于農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)型升級(jí)的關(guān)鍵時(shí)期，積極推進(jìn)農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展，減少農(nóng)藥、化肥使用量，促進(jìn)農(nóng)膜、秸稈、畜禽糞污等有機(jī)廢棄物資源循環(huán)再利用，是保護(hù)農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境和生態(tài)文明建設(shè)的重要手段。據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（FAO）的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，與2018年相比，到2030年我國畜禽糞污氮素排放總量將達(dá)到837萬t，增長44.7%。畜禽糞污既是污染物，也是寶貴的養(yǎng)分資源，針對(duì)畜禽糞污與日俱增的環(huán)境污染壓力，加強(qiáng)畜禽糞污生物轉(zhuǎn)化技術(shù)的研究與應(yīng)用，促進(jìn)好氧堆肥技術(shù)發(fā)展，使物質(zhì)和能量得到高效的循環(huán)利用，減少廢棄物排放與化肥投入，有利于我國生態(tài)循環(huán)農(nóng)業(yè)、農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化和可持續(xù)發(fā)展。

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