（5）菌株接種濃度及培養(yǎng)基初始黃曲霉毒素B1濃度對降解效果的影響

菌株接種濃度及培養(yǎng)基初始AFB1濃度對降解效果的影響實驗參考LinZhao等方法并作適當(dāng)修改。取渾濁紅球菌PD630菌種接種于NB培養(yǎng)基，震蕩培養(yǎng)箱中（30⁰C，160r/min）活化36h后得到PD630菌株活化液，調(diào)整0D600控為1.5。菌液按照10%接種量接種于含AFB1的無菌培養(yǎng)基中，AFB1終濃度為0.4μg/mL。無菌NB培養(yǎng)基代替PD630菌液作為空白對照。分別在培養(yǎng)0、12、24、36、48、60和72h后提取樣品中的AFB1，HPLC測定培養(yǎng)基中AFB1殘余濃度，分別接種1%、5%、10%、15%菌液于含AFB1的無菌NB培養(yǎng)基中，使AFB1終濃度為0.4μg/mL，無菌NB培養(yǎng)基作為空白對照。調(diào)整NB培養(yǎng)基中的AFB1使終濃度分別為0.25、0.5、1.0、2.0ug/mL，按10%接種量加入菌株活化液，以AFB1終濃度相同的無菌NB培養(yǎng)基作為空白對照。震蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)（30⁰C，160r/min），分別于0、12、24、36、48、60和72h取樣，提取培養(yǎng)液中殘留的AFB1進(jìn)行HPLC分析。

（6）無細(xì)胞上清、菌細(xì)胞懸液、胞內(nèi)裂解物對黃曲霉毒素B1的降解活性

PD630菌株在30⁰C，160r/min條件下培養(yǎng)72h，菌株發(fā)酵液通過在4⁰C，8000r/min離心20min收集上清及細(xì)胞沉淀物：（a）上清液通過0.22μm無菌濾膜過濾后用于進(jìn)一步實驗；（b）菌體細(xì)胞沉淀用無菌生理鹽水洗滌3次后再次用生，理鹽水重懸，制備得到菌細(xì)胞懸液；（c）取部分菌懸液通過細(xì)胞超聲破碎儀破碎后，細(xì)胞內(nèi)容物在8000r/min，4⁰C離心20min，0.22μm濾膜過濾得到胞內(nèi)裂解液；（d）取部分發(fā)酵液不作任何處理；（e）滅菌備用的NB培養(yǎng)基。

在上述所制備的5種處理液中分別加入AFB1，終濃度為0.4μg/mL。將培養(yǎng)體系置于30⁰C，180r/min黑暗溫育72h后，提取AFB1進(jìn)行HPLC分析。

（7）PD630菌株無細(xì)胞上清對黃曲霉毒素B1的降解效果，按PD630菌株在30⁰C，160r/min條件下培養(yǎng)72h，菌株發(fā)酵液通過在4⁰C，8000r/min離心20min收集上清及細(xì)胞沉淀物：（a）上清液通過0.22μm無菌濾膜過濾后用于進(jìn)一步實驗；（b）菌體細(xì)胞沉淀用無菌生理鹽水洗滌3次后再次用生，理鹽水重懸，制備得到菌細(xì)胞懸液；（c）取部分菌懸液通過細(xì)胞超聲破碎儀破碎后，細(xì)胞內(nèi)容物在8000r/min，4⁰C離心20min，0.22μm濾膜過濾得到胞內(nèi)裂解液；（d）取部分發(fā)酵液不作任何處理；（e）滅菌備用的NB培養(yǎng)基。在上述所制備的5種處理液中分別加入AFB1，終濃度為0.4μg/mL。將培養(yǎng)體系置于30⁰C，180r/min黑暗溫育72h后，提取AFB1進(jìn)行HPLC分析。加入AFB1使終濃度為0.4μg/mL，在30⁰C，180r/min的黑暗條件下培育，分別在0、12、24、36、48、60、72h取樣分析AFB1殘留量。AFB1終濃度相同的無菌NB培養(yǎng)基作為空白對照。

（8）加熱、EDTA、蛋白酶K對無細(xì)胞上清降解黃曲霉毒素B1活性的影響

根據(jù)XiulanSun等方法進(jìn)行研究。為了探究無細(xì)胞上清中的活性成分性質(zhì)，分別沸水浴處理20min；121⁰C高壓滅菌鍋處理10min；0.1MEDTA處理lh；1mg/mL蛋白酶K在55⁰C下處理lh。處理結(jié)束后在各處理上清液中加入AFB1，令A(yù)FB1終濃度為0.4ug/mL，在30⁰C，180r/min的培養(yǎng)條件下黑暗溫育72h。AFB1終濃度相同的無菌NB培養(yǎng)基作為空白對照，溫育結(jié)束后提取AFB1進(jìn)行HPLC分析。

4、數(shù)據(jù)處理

采用Originpro2018和SPSS23.0對本文數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，每組重復(fù)3次。

二、結(jié)果與討論

1、黃曲霉毒素B1的提取及測定，通過：

①高效液相色譜法色譜條件

色譜柱：WatersC18柱（5μm，4.6x150mm）；流動相為乙腈：水=40：60（v/v）；流速：1.0mL/min；柱溫：30⁰C；進(jìn)樣量20uL；檢測器：紫外檢測器；檢測波長365nm。

②黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作及樣品的處理標(biāo)準(zhǔn)

曲線的制作：將lmgAFB1標(biāo)準(zhǔn)品溶解于25mL色譜級甲醇中，得到40μug/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液，保存于-20⁰C冰箱中。將該儲備液用色譜級甲醇精密稀釋，獲得0.5、1、2、4、8μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液。色譜柱：WatersC18柱（5μm，4.6x150mm）；流動相為乙腈：水=40：60（v/v）；流速：1.0mL/min；柱溫：30⁰C；進(jìn)樣量20uL；檢測器：紫外檢測器；檢測波長365nm。按色譜條件進(jìn)行HPLC分析，以溶液濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制AFB1標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算得到回歸方程為：y=74752x—4894.6，R2=0.9998的實驗所述的高效液相色譜法測定得到黃曲霉毒素B1色譜圖。

由圖1可知，該高效液相色譜法對AFB1有良好的分離測定效果，AFB1在紫外波長為365nm的條件下出峰良好，峰形符合液相要求，出峰時間為3.8土0.5min。

2、添加標(biāo)準(zhǔn)品分析黃曲霉毒素B1提取測定方法回收率及精密度

依據(jù)方法學(xué)對黃曲霉毒素B1的提取測定方法進(jìn)行了評估，以保證AFB1結(jié)果測定的可靠性。

AFBI分析方法的回收率及精密度如表1所示。

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