2-氯-6-（三氯甲基）吡啶（nitrapyrin，CP）是一種白色晶狀固體物質。Goring報道了CP具有硝化抑制特性，CP施用到土壤后可顯著抑制硝化細菌的活性，延緩銨態(tài)氮向硝態(tài)氮轉化，減少氮素的淋溶和溫室氣體排放，從而提高了氮素利用率，增加了作物產量。由于使用CP后，易被土壤吸附而降低其有效性，土壤對CP的吸附作用是影響其在土壤環(huán)境中有效性的重要因素，因此建立可同時測定不同類型土壤中CP含量的方法具有重要意義。

高效液相色譜法常用于土壤中有機物的定量分析，該方法成熟、準確度較高.張玉敏等研究了甲基吡啶的高效液相色譜分析方法；王岙等通過液相色譜法同時測定兩種農藥，解決了用氣相色譜法和質譜法存在保存期短、處理步驟繁瑣及二者分離較難的問題。目前多采用高效液相色譜法分析吡啶類物質，利用反相色譜柱和極性流動相，根據不同吡啶類物質在反相柱的吸附力不同進行分離，不需要高溫氣化，測定更易實現。土壤中有機物的提取方法主要包括索氏提取、超聲萃取和壓力萃取等，其中索氏提取法提取率較高，但存在耗時、有機溶劑消耗量大及操作復雜等缺點；壓力萃取需配備專用儀器，成本較高；超聲波提取操作簡單、節(jié)能且省時省力。超聲萃取-高效液相色譜分析法操作簡單，成本較低，由于CP化合物的極性為中性，沸點較低，其在土壤中的提取和含量測試方法目前尚未見文獻報道。因此本文用超聲萃取-高效液相色譜法測定土壤中的CP，用AgilentSB-C18色譜柱，優(yōu)化流動相最佳體積比和最佳流速，測定不同土壤類型中CP的質量濃度。

一、材料與方法

1、儀器與試劑
高效液相色譜儀（安捷倫1260型，美國安捷倫公司）：六通閥進樣器、紫外檢測器和色譜柱（AgilentSB-C18不銹鋼柱（4.6mm×150mm，5μm））；高速冷凍離心機（Z36HK型，德國HERMLE公司）；恒溫水浴振蕩器（SHA-C型，常州華普達儀器有限公司）。CP乳油（質量分數30%，實驗室制備）；CP微囊懸浮劑（質量分數10%，實驗室制備）；甲醇、乙醇和乙腈（色譜純，上海國藥集團化學試劑有限公司）；CP原藥（質量分數≥98.0%，上海甄準生物科技有限公司）；CP標準品（質量分數≥99.0%，德國LGCLabortG-mbH·Bgm公司）；實驗用水均為二次去離子水。

2、供試土壤

選擇草甸黑土、黑鈣土和風沙土3種供試土壤.在吉林農業(yè)大學農業(yè)科學試驗站采集草甸黑土；在吉林省農安縣農田采集黑鈣土；在吉林省梨樹縣農業(yè)科學試驗站采集風沙土。樣品采集地點均為連續(xù)多年種植玉米的土地，且無硝化抑制劑CP的使用記錄，土壤采樣深度為0～20cm，自然風干，剔除動植物殘體，過2mm篩，于密封袋中保存?zhèn)溆谩?種供試土壤的基本性質列于表1。

3、方法

（1）流動相條件：用高效液相色譜法測定氯化產物及產品中CP的質量比。將流動相設為：V（甲醇）：V（水）=9，V（甲醇）：V（水）=4，V（甲醇）：V（水）=7∶3；V（乙腈）：V（水）=9，V（乙腈）：V（水）=4，V（乙腈）：V（水）=7∶3。測定CP標準溶液（50mg/L）的色譜圖。

（2）檢測波長用紫外檢測器在190～400nm內對CP標準溶液（50mg/L）進行紫外區(qū)光譜掃描。

（3）流動相流速，用高效液相色譜法測定氯化產物及產品中CP的質量濃度。考慮土壤浸提液中雜質與CP的分離效果，將流動相流速分別設為0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4mL/min，考察不同流速對CP色譜峰峰型和保留時間的影響。

（4）標準曲線制作用分析純乙醇和CP標準品分別配制0，2，5，10，20，25，45，75mg/L的CP溶液，以CP質量濃度和對應峰面積繪制標準曲線。

4、測定方法評價指標

（1）檢出限對空白土壤樣品連續(xù)進樣測定20次，根據峰面積計算標準偏差，按計算檢出限。其中：D為檢出限；q為標準偏差；S為方法的靈敏度，即回歸線方程的斜率。

（2）準確度和精密度

①在最佳測定條件下，對CP標準溶液重復進樣10次，計算標準偏差和變異系數。

②在3種土壤（CP無檢出）中分別添加低質量濃度（25mg/L）和高質量濃度（75mg/L）的CP標準溶液，m（固）∶V（液）=5，重復3次，于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，取1.50g于碘量瓶中，先分別用15，15，5mL分析純乙醇各超聲10min提取土壤中的CP，再于10000r/min離心，上清液用0.45μm有機濾膜過濾，低溫（-20℃）保存?zhèn)溆?，在最佳測定條件下測定不同類型土壤中CP的質量比，計算標準偏差和變異系數。

③選擇CP乳油和CP微囊懸浮劑兩種劑型，分別稱取土壤10.00g，在土壤中分別添加2mL質量濃度為50mg/L不同劑型的CP水溶液，充分混勻，重復3次，于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，取1.50g于碘量瓶中，先分別用15，15，5mL分析純乙醇各超聲10min提取土壤中的CP，再于10000r/min離心，上清液用0.45μm有機濾膜過濾，低溫（-20℃）保存?zhèn)溆?，在最佳測定條件下測定不同劑型中CP的質量比，計算標準偏差和變異系數。

5、數據處理方法用SPSS17.0軟件處理數據，用單因素方差分析法分析差異顯著性（Duncan新復極差法，p＜0.05），用Oringe8.5軟件繪制圖表，通過色譜工作站（ChemStationEditionforLCandLC/MSsystems，C0.01.05）處理數據。

二、結果與討論

1、優(yōu)化CP測定條件

當用色譜法分析吡啶類物質時，選用C18色譜柱較多。由于高效液相色譜法測定吡啶類物質時的色譜柱類型、流動相、流速和檢測波長等均顯著影響樣品的測定準確度，因此本文研究不同流動相及不同比例、流動速度和檢測波長等因素對CP質量比測定的準確度、精密度和檢測限的影響，并用超聲萃取法測定不同類型土壤中的CP質量比。

（1）檢測波長的選擇

當溫度為25℃，V（乙腈）V（水）=4的溶液為流動相，流速為0.8mL/min時，CP標準溶液（50mg/L）的紫外光譜如圖1所示。由圖1可見，在λ=285nm處有強吸收峰，為芳香環(huán)體系特征吸收峰，因此在該波長處的檢測靈敏度較高，可作為CP的檢測波長。

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