氨基酸對烘烤牛肉餅中雜環(huán)胺的抑制作用（一）

發(fā)布時間：2021-09-06 21:28 編輯者：特邀作者周世紅

雜環(huán)胺是富含蛋白質(zhì)的食品原料(如肉類等)在熱加工過程中產(chǎn)生的一類有害物質(zhì)。大量研究表明。該類物質(zhì)通過與DNA共價結(jié)合產(chǎn)生致癌、致突變毒性。國際癌癥研究機構(gòu)(IARC)1993年經(jīng)將喹啉類，包括2-氨基-3-甲基-3H-咪唑并[4，5-f]喹啉(IQ)歸為2A級致癌物，2-氨基-3，4-二甲基咪唑并[4，5-f]喹啉(MeIQ)、8-MeIQx、2-氨基-1-甲基-6苯基咪唑并[4，5-b]吡啶(PhIP)、2-氨基-9H-吡啶并[2，3-b1]吲哚(AαC)和2-氨基-3甲基-9H-吡啶并[2，3-b]吲哚(MeAoαC)等歸為2B級致癌物。流行病學研究表明，雜環(huán)胺的攝入會增加罹患食道癌、胃癌和胰腺癌等的風險，因此雜環(huán)胺的生成途徑和減控受到越來越多的關(guān)注。

目前有研究表明。在食品體系中添加一些抑制劑可以抑制雜環(huán)胺的產(chǎn)生，如添加人工合成的抗氧化劑同。草藥和茶葉提取物等天然提取物以及香辛料等。然而，合成抗氧化劑的安全性，以及在不同區(qū)域生長的草藥/香料的成分不同和高純度的天然抗氧化劑提取成本過高，都會限制其在食品工業(yè)中的使用。

氨基酸已廣泛用于食品中以增加其營養(yǎng)價值?；蛲ㄟ^與其它食品成分的美拉德反應來增強食品的風味。此外，有報道稱美拉德反應產(chǎn)物(MRP)有許多健康益處，例如已發(fā)現(xiàn)葡萄糖和組氨酸的MRP具有自由基清除活性，并且已鑒定出葡萄糖一組氨酸MRP中具有強抗氧化物質(zhì)舊。有報道稱，一些氨基酸可以抑制雜環(huán)胺形成，如色氨酸、賴氨酸和脯氨酸可以顯著抑制模擬體系中PhIP的形成，并通過添加氨基酸減少苯乙醛(美拉德反應中PhIP不可缺少的中間體)的生成。這表明它們可能通過清除苯乙醛抑制PhIP形成。另一項研究表明，在模擬體系中，200℃加熱5min，可形成PhIP-甘氨酸加合物，這很可能是甘氨酸的羧基和PhIP的氨基進行脫水縮合；這項研究還發(fā)現(xiàn)，加熱PhIP可以誘導其與其它各種氨基酸結(jié)合，表明氨基酸可通過形成加合物的形式抑制PhIP的形成。

本試驗使用4種非雜環(huán)胺前體及在模擬體系中具有最強PhIP抑制能力的氨基酸—組氨酸、亮氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸作為雜環(huán)胺抑制劑，添至待烘烤牛肉餅中，探究氨基酸對烘烤牛肉餅中雜環(huán)胺產(chǎn)生及其理化性質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

17種雜環(huán)胺標準品，包括PhIP、DMIP、去甲哈爾滿(Norhaman)、哈爾滿(Harman)、MeIQx、IQx、7，8-DiMeIQx、4，8-DiMeIQx、4，7，8-rniMeIQx、MeIQ、IQ、IQ[4，5-b]、Phe-P-1、1，5，6-TMIP、MeAo[C、A儀C、Glu-P-1，美國SantaCmz公司，所有標準品的純度均高于99％；硅藻土、組氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和脯氨酸，百靈威公司(中國北京)，所有標準品的純度均高于99％；OasisMCX(3cc/60mg)固相萃取柱，美國Waters公司；U-PLC-MS級乙腈、甲醇和甲酸，美國Thermo-Fisher公司；乙酸乙酯、甲醇、氨水、氫氧化鈉為分析級，中國上海國藥化學試劑有限公司；牛里脊肉，購于無錫歐尚超市。

超高效液相色譜串聯(lián)四極桿質(zhì)譜，使用Ac-quityUPLCBEHC18柱(100mm×2.1mm，1.7μm)，美國Waters公司；visiprep型固相萃取儀，美國Sigma公司；氮吹儀，上海泉島公司；電子天平，瑞士MettlerToledo公司；IKAT-18型均質(zhì)機，德國IKA公司：烤箱RationalSCC61ESelf-cookingCenter，?；鶉鳱ational公司；Sigma3K15型冷凍離心機，美國Sigma公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 烘烤牛肉餅的制作

1) 空白組的制作

取絞碎牛里脊肉(40±0.1)g置于直徑6cm培養(yǎng)皿上，制成約1cm厚的牛肉餅，225℃烤制20min(10min/面)。烤好的肉餅冷卻后凍干。粉碎機粉碎，于-20℃冰箱貯存?zhèn)溆谩Ｃ總€樣品做3個平行。

2) 試驗組的制作

在空白組基礎上，分別添加質(zhì)量分數(shù)0.01％，0.05％和0.10％的組氨酸、亮氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸于鮮肉中。其余制作與烤制方法同空白組，每個樣品做3個平行。

1.2.2 烘烤牛肉餅基本組分的測定

樣品中水分、蛋白質(zhì)、脂肪和礦物質(zhì)，pH值測定分別參照國家標準GB5009.3-2016《食品中水分的測定》、GB5009.5-2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》、GB5009.6-2016《食品中脂肪的測定》、GB5009.4-2016《食品中灰分的測定》Ⅲ和GB5009.237-2016《食品pH值的測定》。

1.2.3 烘烤牛肉餅質(zhì)構(gòu)的測定

將肉餅切成1cm3的正方體，做雙循環(huán)壓縮試驗，測定其硬度、凝聚性、咀嚼性和彈性。質(zhì)構(gòu)測定試驗條件：預測試速度1.0mm/s。測試速度2.0mm/s，測試后速度2.Omm/s，應變力75％，觸發(fā)類型為自動型，觸發(fā)力5.0g。

1.2.4 烘烤牛肉餅中游離態(tài)和結(jié)合態(tài)雜環(huán)胺的測定

離態(tài)雜環(huán)胺的提取參考Chen等閻的方法。稱取4g牛肉餅粉末，加入30mL1mol/L氫氧化鈉溶液，均質(zhì)1min，將肉糜轉(zhuǎn)移至盛有14g硅藻土的三角瓶中，加入50mL乙酸乙酯，混勻后超聲萃取2次。每次30min，所得上清液即游離態(tài)雜環(huán)胺提取液，用于固相萃取。固相萃取操作參考文獻。

色譜條件：UPLCBEHC18(100mm×2.1mm，1.7μm)色譜柱；柱溫45℃；流動相A為100％乙腈，流動相B為3mmol/L乙酸銨(pH4.75)；洗脫梯度：O～0.1min為4％A，0.1～18min為40％A，18～20min為70％A：20～22min為100％A；22～22.1min為4％A；流速0.3mL/min；樣品室溫度4℃；柱溫45℃；進樣量5μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧(ESI)電離源，正離子模式；選擇多反應監(jiān)測模式：離子源溫度110℃：脫溶劑氣溫度400℃；脫溶劑氣流量(氮氣)700L/h；毛細管電壓3.5kV；錐孔氣流量(氮氣)50m；碰撞氣流量(氬氣)0.13mL/min；掃描范圍2～2000u。

1.2.5 方法學驗證

1) 線性范圍

稱取17種雜環(huán)胺標品各2mg，用色譜甲醇定容2mL，得到1mg/mLHAs單標母液，稀釋10倍得到100μL工作液。將各單標溶液稀釋后混合配制為混標溶液，稀釋數(shù)倍后進行標準曲線測定。以HAs的質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得到各HAs質(zhì)量濃度與峰面積間的線性回歸方程。