鹽漬辣椒制作過(guò)程中常添加15%以上的食鹽，0.05%～0.1%的CaCl2及0.05‰～0.1‰的焦亞硫酸鈉，因此該類(lèi)辣椒保藏時(shí)間較長(zhǎng)，且能保持較脆的辣椒口感，是剁辣椒加工過(guò)程中一類(lèi)原料。鹽漬辣椒的質(zhì)量好壞，直接影響中、低鹽再加工品的質(zhì)量和安全。近年來(lái)，鹽漬辣椒的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，中、低鹽再加工品的提質(zhì)以及鹽漬辣椒的微生物多樣性等逐漸引起從業(yè)人員的重視。

現(xiàn)階段微生物多樣性研究報(bào)道多集中在環(huán)境土壤湖泊等領(lǐng)域，而食品方向以釀酒領(lǐng)域居多，發(fā)酵蔬菜類(lèi)以韓國(guó)泡菜居多，而發(fā)酵辣椒多樣性研究鮮見(jiàn)。454焦磷酸測(cè)序技術(shù)測(cè)序已成熟應(yīng)用到微生物菌落鑒定中，能有效分析出樣品生態(tài)環(huán)境中原始微生物的組成及其比重。趙玲艷等研究發(fā)現(xiàn)線(xiàn)椒自然發(fā)酵過(guò)程中的真菌可歸屬到39個(gè)屬、56個(gè)種，優(yōu)勢(shì)真菌為漢遜酵母屬，米椒自然發(fā)酵過(guò)程中的真菌可歸屬到60個(gè)屬、96個(gè)種，優(yōu)勢(shì)真菌為漢遜酵母屬和畢赤酵母屬。

本研究采用454焦磷酸測(cè)序技術(shù)研究鹽漬辣椒中真菌多樣性，以確定鹽漬辣椒中真菌群落結(jié)構(gòu)及相對(duì)豐度。在此基礎(chǔ)上，研究鹽漬辣椒細(xì)菌多樣性，分析高鹽腌漬辣椒過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)及相對(duì)豐度的變化，為安全生產(chǎn)腌漬辣椒，保障產(chǎn)品質(zhì)量，提高風(fēng)味提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)原料

鹽漬米椒（C.annuumL.var.dactylusM）、鹽漬線(xiàn)椒（C.annuumL.var.conoidesＩrish），湖南壇壇香食品科技有限公司。

1.2 主要試驗(yàn)試劑

E.Z.N.A.SoilDNA試劑盒、TransStartFastpfuDNA聚合酶、AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒、RocheGSFLXTitaniumemPCR試劑盒、Manual_XLR70試劑盒，美國(guó)OmegaBio-Tek公司。

1.3 儀器與設(shè)備

DYY-6C型凝膠電泳儀，北京市六一儀器廠(chǎng)；GeneAmpR9700型PCR儀，美國(guó)ABＩ；QuantiFluorTM-ST熒光定量系統(tǒng)，美國(guó)Promega；RocheGSFLX測(cè)序儀，瑞士Roche。

1.4 方法

1.4.1 樣品采集

本研究以鹽漬線(xiàn)椒及鹽漬米椒為對(duì)象，選擇色澤、風(fēng)味較好的樣品，無(wú)菌操作取樣帶回實(shí)驗(yàn)室，-80℃冰箱保存。

1.4.2 理化指標(biāo)的測(cè)定

總酸：參照GB/T12456-2008測(cè)定；NaCl：參照GB/T12457-2008測(cè)定；水分：直接干燥法測(cè)定；辣椒素：參照GB-T21266-2007測(cè)定。

1.4.3 樣品中微生物DNA的提取

參照OMEGA公司E.Z.N.ASoilDNA試劑盒抽提方法提取DNA。

1.4.4 擴(kuò)增產(chǎn)物定量及測(cè)序

正反向引物（27F5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，533R5’-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3’），帶有5’端454測(cè)序A、B接頭的特異引物和3’端的融合引物，其中A為測(cè)序端，需要加上條碼（barcode），B端引物可以共用。PCR采用20μL反應(yīng)體系。

1.4.5 PCR產(chǎn)物定量、測(cè)序

PCR產(chǎn)物熒光定量，要求總量＞100ng，要求PCR產(chǎn)物濃度>5ng/μL，OD260/280值在1.8～2.0左右，未降解，根據(jù)454RocheGS-FLX測(cè)序。

1.4.6 生物信息分析方法

數(shù)據(jù)采取Qiime軟件去雜，生物信息學(xué)分析以去除嵌合體、分類(lèi)學(xué)分析、OTU聚類(lèi)、比對(duì)分析等。計(jì)算α多樣性指數(shù)后，進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)組分、繪制熱圖（Heatmap）、PCA分析、豐度等級(jí)（Rank-Abundance）和多樣性（Shannon-Wiener）曲線(xiàn)繪制等分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽漬米椒和線(xiàn)椒的理化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

鹽漬米椒和鹽漬線(xiàn)椒的辣椒素、水分、總酸、食鹽含量的變化見(jiàn)表1。從表1可以看出，鹽漬米椒的辣椒素含量為26120SHU，水分含量為65.10%，總酸含量為0.82%，食鹽含量為14.48%；鹽漬線(xiàn)椒的辣椒素含量為2412SHU，水分含量為73.18%，總酸含量為0.15%，食鹽含量為21.61%。

2.2 鹽漬線(xiàn)椒和米椒細(xì)菌和真菌的稀疏性曲線(xiàn)

鹽漬線(xiàn)椒和鹽漬米椒細(xì)菌和真菌的稀疏性曲線(xiàn)見(jiàn)圖1。由圖1可以看出，當(dāng)細(xì)菌測(cè)序量增加到5000，真菌測(cè)序量增加到2000左右時(shí)，測(cè)序數(shù)據(jù)達(dá)到飽和，試驗(yàn)設(shè)定細(xì)菌10000條序列、真菌5000條序列的測(cè)序深度是合理的。鹽漬線(xiàn)椒細(xì)菌和真菌稀疏性曲線(xiàn)分別比鹽漬米椒細(xì)菌和真菌的稀疏性曲線(xiàn)陡、高，鹽漬線(xiàn)椒的細(xì)菌和真菌多樣性分別高于鹽漬米椒的細(xì)菌和真菌多樣性。

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