一、概述維生素是維持人體正常生理功能所必需的一類有機營養(yǎng)素。食品中維生素的含量都很低，因此，對維生素的分析需采用精密度高的分析方法。主要方法有比色法、紫外分光光度法、高效液相色譜法、氣相色譜法、熒光法等。另外，化學(xué)分析法中的滴定法，具有簡便、快速、不需特殊儀器等優(yōu)點，為廣大基層實驗室所普遍采用。

二、脂溶性維生素的測定

(一)維生素A和維生素E的測定--高效液相色譜法

1、原理試樣中的維生素A及維生素E經(jīng)皂化處理后，將其從不可皂化部分提取至有機溶劑中。用高效液相色譜反相柱(RP-C18)，將維生素A和維生素E分離，經(jīng)紫外檢測器檢測，并用內(nèi)標(biāo)法定量測定。

2、儀器

①高效液相色譜儀(帶紫外檢測器)。②旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。③速離心機。④離心管：具塑料蓋，1.5~30mL塑料離心管(與高速離心機配套)。⑤高純氮氣。⑥恒溫水浴鍋。⑦外檢測器。

3、試劑

①無水乙醚：不含有過氧化物。

a.過氧化物的檢查方法用2mL乙醚，加1mL10％碘化鉀溶液，振搖1min，如有過氧化物則放出游離碘，水層呈黃色或加4滴0.5％淀粉溶液，水層呈藍色。該乙醚需處理后使用。

b．去除過氧化物的方法重蒸餾乙醚時，瓶中放入純鐵絲或鐵末少許，棄去10％初液和10％殘餾液。

②無水乙醇：不得含有醛類物質(zhì)。

a.檢查方法取2mL銀氨溶液于試管中，加入少量乙醇，搖勻，再加入氫氧化鈉溶液，加熱，放置冷卻后，若有銀鏡反應(yīng)則表示乙醇中有醛。

b．脫醛方法取2g硝酸銀溶于少量水中，取4g氫氧化鈉溶于溫乙醇中，將兩者傾入1L乙醇中，振搖后，放置暗處2d(不時搖動，促進反應(yīng))，經(jīng)過濾，置蒸餾瓶中蒸餾，棄去初蒸出的50mL。當(dāng)乙醇中含醛較多時，硝酸銀用量適當(dāng)增加。

③無水硫酸鈉。

④甲醇：重蒸后使用。

⑤重蒸水：水中加少量高錳酸鉀，臨用前蒸餾。

⑥抗壞血酸溶液(100g/L)：臨用前配制。

⑦氫氧化鉀溶液(1+1)。

⑧氧化鈉溶液(100g/L)。

⑨酸銀溶液(50g/L)。

⑩氨溶液：加氨水至硝酸銀溶液(50g/L)中，直至生成的沉淀重新溶解為止，再加氫氧化鈉溶液(100g/L)數(shù)滴，如發(fā)生沉淀，再加氨水直至溶解。

?維生素A標(biāo)準(zhǔn)溶液：視黃醇(純度85%)或視黃醇乙酸酯(純度95％)經(jīng)皂化處理后使用。用脫醛乙醇溶解維生素A標(biāo)準(zhǔn)品，使其濃度大約為lmL相當(dāng)于1mg視黃醇。臨用前用紫外分光光度法標(biāo)定其準(zhǔn)確濃度。

?生素E標(biāo)準(zhǔn)溶液：a-生育酚(純度95％)、γ-生育酚(純度95％)、δ-生育酚(純度95％)。用脫醛乙醇分別溶解以上三種維生素E標(biāo)準(zhǔn)品，使其濃度大約為1mL相當(dāng)于1mg三種生育酚。臨用前用紫外分光光度計分別標(biāo)定此三種生育酚溶液的準(zhǔn)確濃度。

?內(nèi)標(biāo)溶液：稱取苯并[e]芘(純度98％)，用脫醛乙醇配制成每1mL相當(dāng)10μg苯并[e]芘的內(nèi)標(biāo)溶液。

4、操作方法

(1)試樣處理

①皂化：準(zhǔn)確稱取1~10g試樣(含維生素A約3μg，維生素E各異構(gòu)體約為40μg)于皂化瓶中，加30mL無水乙醇，進行攪拌，直到顆粒物分散均勻為止。加入5mL10％抗壞血酸、苯并[P]芘標(biāo)準(zhǔn)液2.00mL，混勻，加10mL氫氧化鉀溶液(1+1)，混勻。于沸水浴回流30min，使皂化完全。皂化后立即放入冰水中冷卻。

②提?。簩⒃砘蟮脑嚇右迫敕忠郝┒分校?0mL水分2~3次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中，用約100mL乙醚分兩次洗皂化瓶及其殘渣，乙醚液并入分液漏斗中。如有殘渣，可將此液通過有脫脂棉的漏斗濾入分液漏斗中。輕輕搖動分液漏斗2min，靜置分層，棄去水層。

③洗滌：用約50mL水洗分液漏斗中的乙醚層，用pH試紙檢驗直至水層不顯堿性(最初水洗輕搖，逐次振搖強度可增加)。

④濃縮：將乙醚提取液經(jīng)過無水硫酸鈉(約5g)濾入與旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器配套的250~300mL球形蒸發(fā)瓶內(nèi)，用約100mL乙醚沖洗分液漏斗及無水硫酸鈉3次，并入蒸發(fā)瓶內(nèi)，并將其接至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上，于55℃水浴中減壓并回收乙醚，待瓶中剩下2mL乙醚時，取下蒸發(fā)瓶，立即用氮氣吹掉乙醚，立即加入2.00mL乙醇，充分混合，溶解提取物。將乙醇液移入一小塑料離心管中離心5min(5000r/min)。上清液供色譜分析。如果試樣中維生素含量過少，可用氮氣將乙醇液吹于后，再用乙醇重新定容，并記下體積比。

(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

①維生素A和維生素E標(biāo)準(zhǔn)濃度的標(biāo)定：取維生素A和各維生素E標(biāo)準(zhǔn)液若干微升，分別稀釋至3.00mL乙醇中，并分別按給定波長測定各維生素的吸光值。用吸光系數(shù)計算出該維生素的濃度。測定條件如表1所示。

濃度按下列公式計算：

式中 ：

c₁--維生素的濃度，g/mL；

A--維生素平均紫外吸光值；

V--加入標(biāo)準(zhǔn)液的量，μL；

E--某種維生素1%吸光系數(shù)；

3.00/V*10^-3 --標(biāo)準(zhǔn)液稀釋倍數(shù)。

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