食源性致病菌的污染和增殖是嚴(yán)重威脅食品安全和公共健康的因素之一，成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。根據(jù)世界衛(wèi)生組織最新的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，世界上每年有近十分之一的人因食品污染而患病，近42萬(wàn)人死于食源性疾病。食品添加劑作為延長(zhǎng)食品貨架期的一種手段，可以抑制食源性致病菌的生長(zhǎng)，然而食品添加劑潛在危害及添加劑量成為消費(fèi)者擔(dān)憂的問(wèn)題。同時(shí)，抗生素作為主要抑制食源性疾病的源頭藥物，其長(zhǎng)期濫用導(dǎo)致食源性致病菌的耐藥性問(wèn)題愈發(fā)嚴(yán)重。鑒于此，研究人員不斷尋找天然的防腐劑以及不易產(chǎn)生耐藥性的天然抗菌物質(zhì)作為食品添加劑及抗生素的替代品。

細(xì)菌素是細(xì)菌核糖體內(nèi)合成的一類具有抑菌活性的多肽或蛋白類物質(zhì)，主要對(duì)親緣關(guān)系較近的微生物有一定的抑制作用。細(xì)菌素具有高效、無(wú)毒、穩(wěn)定性強(qiáng)、無(wú)殘留以及不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)，被普遍認(rèn)為是抗生素及化學(xué)添加劑的替代物之一。目前真正用于商業(yè)化的乳酸菌細(xì)菌素僅有乳酸鏈球菌素（nisin）和片球菌素（pediocinPA1）。造成這種現(xiàn)象的原因主要是乳酸菌細(xì)菌素的性質(zhì)（如有些乳酸菌細(xì)菌素抑菌譜窄、pH敏感性及熱穩(wěn)定性差）和分離純化方法等諸多因素限制了乳酸菌細(xì)菌素的獲取及其工業(yè)化生產(chǎn)。篩選具有廣譜抑菌作用，pH耐受范圍廣，熱穩(wěn)定性好的新型細(xì)菌素對(duì)食品安全具有重要意義。

芽孢桿菌（Bacillussp.）作為動(dòng)植物和微生態(tài)的優(yōu)勢(shì)菌，不僅種類繁多、穩(wěn)定性強(qiáng)，而且廣泛存在于自然界中。由芽孢桿菌中地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）、枯草芽孢桿菌（B.subtilis）、凝結(jié)芽孢桿菌（B.coagulans）等產(chǎn)生的細(xì)菌素也逐步被關(guān)注和發(fā)現(xiàn)。本研究從福建霞浦海域的牡蠣中分離出不同的細(xì)菌，并以常見(jiàn)的食源性致病菌：金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、蠟樣芽孢桿菌（B.cereus）、副溶血性弧菌（Vibrioparahemolyticus）等為指示菌，系統(tǒng)篩選具有廣譜抑菌作用的產(chǎn)細(xì)菌素的細(xì)菌。其中分離出具有廣譜抑菌活性的14株細(xì)菌經(jīng)16srDNA基因鑒定為芽孢桿菌。這些芽孢桿菌所產(chǎn)的細(xì)菌素主要是由核糖體合成，并具有熱穩(wěn)定性和酶敏感性等特點(diǎn)。結(jié)合Ｔricine-SDS-PAGE電泳試驗(yàn)結(jié)果及LC-MS/MS鑒定，潛在細(xì)菌素的分子質(zhì)量范圍及對(duì)應(yīng)的氨基酸序列均顯示上述廣譜細(xì)菌素可能未被發(fā)現(xiàn)。本研究發(fā)現(xiàn)的新型廣譜細(xì)菌素期望為細(xì)菌素的開(kāi)發(fā)利用及其在食品安全領(lǐng)域的應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品

牡蠣產(chǎn)自福建霞浦海域，樣品放置于-18℃運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室備用。

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)備

低溫恒溫培養(yǎng)箱（MIR-153），日本三洋（SANYO）電機(jī)公司；立式壓力蒸汽滅菌器（YXQ-LS-50SII），上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；水平電泳槽及成像系統(tǒng)，美國(guó)Bio-rad公司；超凈工作臺(tái)（SEX-ＴＪ），上海整新電子設(shè)備；天平Y(jié)P200N，上海菁海儀器有限公司；PCR儀（2720ＴhermalCycler），美國(guó)Ｔhermo公司；樣品處理儀（MPFastprep-24），美國(guó)MP公司。

1.2.2 主要試劑

瓊脂粉，上海藍(lán)季生物科技有限公司；甘油、瓊脂糖，均購(gòu)于國(guó)藥；基因組DNA提取試劑盒、DNAMaker、4sGreen無(wú)毒核酸染料、PCR引物，上海生工生物技術(shù)有限公司；Ｔaq酶、ddH2O，上海拜力生物科技有限公司；腦心浸出液（BrainHeartInfusion，BHI）培養(yǎng)基、乳酸菌培養(yǎng)基（MRS），英國(guó)OXIOD公司。

1.2.3 指示菌株

本次試驗(yàn)的指示菌株均由中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所保存，所需的指示菌及培養(yǎng)條件等見(jiàn)表1。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理

無(wú)菌條件下，稱取10g牡蠣肉剪碎研磨，添加到裝有90mL生理鹽水的樣品處理袋中，將樣品在處理器中均質(zhì)混勻2min，用生理鹽水梯度稀釋至10^-4備用。

1.3.2 菌株分離與培養(yǎng)

采用稀釋涂布平板法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行單菌落分離。分別從10^-3、10^-4兩個(gè)稀釋度的稀釋液中吸取100μL樣品液于BHI培養(yǎng)基上，均勻涂布后置于30℃條件下過(guò)夜培養(yǎng)。長(zhǎng)出菌落后，無(wú)菌條件下挑選單菌落，接種于5mLBHI液體培養(yǎng)基中，置于30℃條件下過(guò)夜培養(yǎng)。

1.3.3 產(chǎn)細(xì)菌素菌株的篩選

1.3.3.1 初篩

采用瓊脂點(diǎn)種法進(jìn)行細(xì)菌素初篩試驗(yàn)。將100μL過(guò)夜培養(yǎng)的指示菌添加到5mLBHI培養(yǎng)基（含0.8%的瓊脂粉）中，倒入BHI培養(yǎng)基（含2.5%的瓊脂粉）上，均勻平鋪。待其冷卻凝固并且干燥后，吸取2μL指標(biāo)菌進(jìn)行點(diǎn)樣，置于30℃條件下過(guò)夜培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，在培養(yǎng)基上出現(xiàn)明亮抑菌圈的則認(rèn)為有抑菌活性，能抑制相應(yīng)的指示菌。對(duì)有抑菌活性的菌株在體積分?jǐn)?shù)13%的甘油中保存，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3.2 細(xì)菌素對(duì)熱和酶的穩(wěn)定性測(cè)試

1）細(xì)菌素的熱穩(wěn)定性試驗(yàn)：將過(guò)夜培養(yǎng)的指標(biāo)菌液在10000r/min條件下離心5min。將上清液在沸水中放置15min，然后冰上冷卻5min。吸取3μL加熱后的上清液，進(jìn)行瓊脂點(diǎn)種法進(jìn)行抑菌，未經(jīng)熱處理的上清液作為對(duì)照。

2）細(xì)菌素對(duì)酶的穩(wěn)定性測(cè)試：將指標(biāo)菌過(guò)夜培養(yǎng)，吸取2μL菌液，采用瓊脂點(diǎn)種法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)；在點(diǎn)過(guò)指標(biāo)菌位置的邊緣，點(diǎn)上1μL質(zhì)量濃度為20μg/mL的蛋白酶K，30℃條件下過(guò)夜培養(yǎng)。未經(jīng)蛋白酶K處理的菌液作為對(duì)照。

1.3.4 產(chǎn)細(xì)菌素菌株的分類鑒定

1.3.4.1 形態(tài)特征

參照文獻(xiàn)進(jìn)行菌株形態(tài)特征鑒定。將菌株接種于BHI平板，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，觀察各個(gè)平板菌落形態(tài)，采用革蘭氏染色法觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.3.4.2 菌株基因組DNA提取，PCR擴(kuò)增和菌株鑒定

對(duì)具有抑菌效果的指標(biāo)菌，按生工Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒（上海生工）提供的使用方法提取其DNA。以指示菌基因組DNA作為PCR擴(kuò)增的模板，采用通用引物15F和12R（表2）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（50μL）：ＴaqPCRMasterMix（2x，bluedye）（上海生工）25μL，上游引物（10μmol/L）2μL，下游引物（10μmol/L）2μL，基因組DNA模板2μL，雙蒸水19μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4min；進(jìn)入PCR循環(huán)階段后，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳后在UＶ燈下觀察到擴(kuò)增條帶后將未純化的PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行菌種鑒定。測(cè)序結(jié)果所得的基因序列通過(guò)在NCBI的Blast檢索系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLASＴ序列比對(duì)。

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