洋蔥(AlliumcepaL.)是重要的園藝蔬菜之一，主要用于國內(nèi)市場鮮食和脫皮保鮮加工出口。國內(nèi)種植戶生產(chǎn)的洋蔥采收后直接銷售，均由經(jīng)銷商、加工企業(yè)收購和存儲，種植戶很少會自留存儲。近幾年，在市場調(diào)查發(fā)現(xiàn)，洋蔥的存儲腐爛現(xiàn)象越來越重，尤其是全年加工洋蔥出口企業(yè)，因原料需要大量存儲，經(jīng)常發(fā)生同一產(chǎn)區(qū)、不同品種集中腐爛的問題。種植戶、收購商會及時銷售，而常年洋蔥加工企業(yè)受損最嚴(yán)重。連云港海灣現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司是江蘇最大的洋蔥加工出口企業(yè)，室外層架和低溫冷庫存儲均會發(fā)生腐爛。對加工企業(yè)而言，腐爛的洋蔥不能作為原料使用。篩選腐爛洋蔥除了肉眼觀察，Nishino等開發(fā)了雙光束光譜測量，改進(jìn)了洋蔥鱗莖內(nèi)部腐爛的檢測方法，可以在早期篩選出腐爛的洋蔥，避免加工保鮮產(chǎn)品出口后出現(xiàn)腐爛現(xiàn)象。本研究對引起腐爛的主要病菌進(jìn)行調(diào)查與鑒定，分析產(chǎn)生的原因，并提出相應(yīng)對策，以期降低加工企業(yè)因洋蔥腐爛造成的損失。

1 材料與方法

1.1 材料

洋蔥品種與主要組培苗基本特征如下:連蔥12號(3B)，圓形，鱗莖球顏色為白色，晚熟品種，日照類型為中日照，來自連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院；950，圓形，鱗莖球顏色為紫色，晚熟品種，日照類型為中日照，來自連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院；GSH，圓形，鱗莖球顏色為黃色，晚熟，日照類型為長日照，由連云港海灣現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司提供。用于黑粉菌侵染試驗組培苗3Y，扁形，鱗莖球顏色為黃色，中晚熟，日照類型為中日照，該品種為無蠟粉突變體，用鱗莖盤未經(jīng)愈傷誘導(dǎo)直接出苗，由連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。

1.2 方法

1.2.1 腐爛率與主要病原菌調(diào)查

洋蔥采收后分別在室外常溫和4℃低溫層架存儲，1個月后隨機(jī)選取上、中、下不同層數(shù)各500個洋蔥球，統(tǒng)計頸部、根部與內(nèi)外部腐爛的個數(shù)，顯微觀察腐爛洋蔥病菌類型。

1.2.2 洋蔥黑霉菌

分離與洋蔥組培苗侵染從洋蔥外表鱗莖上取黑霉菌在MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)3d后挑單菌落培養(yǎng)，然后挑取米粒大小黑霉菌的菌絲，接種洋蔥組培苗3Y。以未接種黑霉菌的組培苗為對照，每批次15瓶，重復(fù)3次，記錄觀察組培苗的生長情況。

1.2.3 洋蔥莖腐病分子鑒定

從頸部腐爛的洋蔥組織中分離出腐爛組織，液氮研磨。每個樣品3次重復(fù)。采用北京天根DP350-03-DNA試劑盒提取DNA。16SrDNA通用引物由蘇州金唯智生物有限公司合成，上游引物:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，下游引物:AAGGAGGTGATCCAGCCGCA。PCR擴(kuò)增試劑購于TAKARA公司，反應(yīng)體系25μL:2μLDNA(0.1μg)，2.5μL10xPCRbuffer，上游引物和下游引物分別1.25μL，2μLdNTPs(10mmol·L^-1)，0.20μLTaq酶和15.80mLddH20。PCR擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性4min；94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，30個循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠檢測，膠回收純化PCR產(chǎn)物，送蘇州金唯智生物有限公司測序，測序結(jié)果用NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析

2 結(jié)果與分析

2.1 洋蔥存儲中腐爛率與主要特征

洋蔥存儲過程中，常溫層架比4℃低溫層架存儲腐爛率高，可能是低溫降低了微生物的繁殖。中日照品種3B和950比長日照品種GSH的腐爛率低，GSH在低溫存儲中腐爛率依然高達(dá)20%(表1)。從腐爛的洋蔥表面觀察到，3B和950從外表鱗莖干枯裂開，直接能夠看到黑色的霉菌，沿著鱗莖紋路，由上端往下，由外表鱗莖向內(nèi)表鱗莖感染，但大部分洋蔥表面均會出現(xiàn)黑霉菌，不至于引起整個洋蔥的腐爛(圖1中A、B)。GSH外部鱗莖無破裂，看起來無腐爛現(xiàn)象，手摸洋蔥頂部會發(fā)軟，有水流出，橫切面發(fā)現(xiàn)由頂部直接往洋蔥中心腐爛(圖1中C、D)。

2.2洋蔥黑霉菌侵染組培苗

將從洋蔥表面分離的黑霉菌單菌落培養(yǎng)后，接種到洋蔥組培苗(3Y)中，20d后黑霉菌長滿整個玻璃瓶，并感染洋蔥組培苗，洋蔥葉片上出現(xiàn)大量的黑霉菌孢子，而未接種的組培苗能夠正常生長(圖2)。

2.3洋蔥莖腐病分子鑒定

洋蔥頸部腐爛組織DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后獲得500bp左右的條帶，測序結(jié)果顯示，獲得482bp序列(圖3)。DNAMAN比對結(jié)果表明，3個樣品中的條帶序列一致性達(dá)99%，初步認(rèn)為這3個樣品中的菌為同一種菌。將序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中Blast比對后，發(fā)現(xiàn)其與真菌葡萄球菌(Botrytisaclada)的相似度達(dá)99%以上。因此，該菌被鑒定為葡萄球菌。
 

3 小結(jié)與討論

洋蔥在存儲中引起腐爛的主要病菌為黑霉菌和葡萄球菌。對不同市場采后洋蔥調(diào)查發(fā)現(xiàn)，黑霉菌發(fā)生率最高。通常在采收后能夠直觀地看到黑霉菌，加工企業(yè)在收儲時能夠較容易辨別；而且加工企業(yè)的產(chǎn)品大部分是脫去最外層鱗莖，因此，黑霉菌對加工產(chǎn)品影響不大。通風(fēng)干燥的存儲條件和低溫干燥都能夠有效降低黑霉菌引起的腐爛率。

在加工企業(yè)存儲過程中，較嚴(yán)重的腐爛是由葡萄球菌引起的莖腐病。本研究中，4℃低溫存儲的長日照品種GSH的腐爛率達(dá)到了20%。該品種的莖腐病具有隱蔽性，在嫩葉中，僅表皮細(xì)胞被感染，采收之前無任何肉眼可見的癥狀，到洋蔥球膨大后期，葉片開始倒伏干枯，葡萄球菌大量萌發(fā)，沿著洋蔥莖往下感染鱗莖，葡萄球菌在快枯黃葉子上形成棕灰色菌絲體，鱗莖上出現(xiàn)凹陷區(qū)域和灰棕色菌絲體。一般在洋蔥收獲后1～2月發(fā)生腐爛。

洋蔥莖腐病的典型特征是從洋蔥球頂部往正中心腐爛，一旦發(fā)生病變，就無法作為保鮮出口產(chǎn)品原料使用。通過調(diào)查連云港海灣現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司發(fā)現(xiàn):洋蔥莖部腐爛情況近幾年比較嚴(yán)重，與收購的品種關(guān)系不大；存儲2個月，正常腐爛率在30%，有些批次洋蔥甚至達(dá)到90%以上。洋蔥莖腐病在田間無任何癥狀，種植戶無需用藥，采收后直接賣出，對種植戶無任何影響。造成洋蔥大面積莖腐病的原因與種植、采收方式有很大關(guān)系。磷肥可以提高洋蔥的耐貯性，氮肥可以降低洋蔥的耐貯性?，F(xiàn)在市售用于洋蔥種植的水溶肥比較多，在種植后期應(yīng)停止灌溉；但為追求產(chǎn)量，種植戶在洋蔥倒伏期前后仍然使用水溶肥灌溉。采收方式也會加重莖腐病的發(fā)生。一般種植戶采收方式是現(xiàn)拔現(xiàn)裝袋、裝車，莖部傷口未愈合，加重了病菌的傳播。上述因素最終導(dǎo)致加工企業(yè)收購洋蔥后，存儲過程中發(fā)生的莖腐病的比例非常高。

2018年8月—11月通過調(diào)查比較洋蔥育種基地存儲的洋蔥和加工企業(yè)存儲的洋蔥發(fā)現(xiàn)，育種基地的洋蔥發(fā)生洋蔥莖腐病比較低。育種基地采收的洋蔥要在座越夏，秋季種植繁種用，為了降低腐爛率，在采收方式上先剪葉子后晾曬，傷口愈合后，下午或第2天才裝袋。同時采收前2周停止氮肥的使用和水大漫灌，所以發(fā)生病害比較輕。為了降低低加工企業(yè)洋蔥腐爛造成的損失，建議制定收購標(biāo)準(zhǔn)，有條件的企業(yè)發(fā)展自己原料生產(chǎn)基地，或與洋蔥主產(chǎn)區(qū)種植大戶或?qū)I(yè)合作社合作，簽訂種植技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。控制室內(nèi)存儲濕度，降低莖腐病的發(fā)生?？蒲杏N單位開展相關(guān)抗病品種的研發(fā)，選育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病、適合加工儲存的洋蔥專用品種。

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