3.1.2 最低檢測限的確定及驗證

最低檢測限的確定及驗證是評價產(chǎn)品性能的重要環(huán)節(jié)。因目前新型冠狀病毒核酸檢測試劑國家參考品均無量值定值，故企業(yè)在研發(fā)過程中無法通過國家參考品進行量值溯源，這就需要企業(yè)對最低檢測限進行合理設定及驗證。在進行最低檢測限的確定時，應至少包含不同來源的三個具有代表性的2019新型冠狀病毒的真實臨床樣本或含有該病毒RNA片段的假病毒顆粒，用適當基質進行系列梯度稀釋，在最低檢測限濃度水平進行驗證，結果應達到90%～95%陽性檢出率。采用科學的方法標定病毒滴度，進行最低檢測限相關的量值研究，并且提供詳細的病毒液滴度的驗證結果。

3.1.3 交叉反應驗證

交叉反應實驗可以直接反應出試劑特異性方面的性能，特異性高的試劑可以減少假陽性樣本的出現(xiàn)。試劑需在病毒和細菌感染的醫(yī)學相關水平進行交叉反應的驗證?！?u>核酸審評要點》中列舉了約50余種病毒和細菌種類，企業(yè)如無法獲得全部種類的樣本，建議至少在冠狀病毒（HKU1、OC43、NL43、229E）、SARS冠狀病毒、MERS冠狀病毒、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等7個大類別中分別挑選代表病毒或細菌樣本進行驗證。其中對于難以獲得真實樣本的類型，如SARS、MERS可用假病毒替代。需提供所有用于交叉反應驗證的病毒和細菌的來源、種屬/型別和濃度確認等相關資料。

3.1.4 精密度檢測方法

《核酸審評要點》中要求精密度性能驗證需要多個臨床樣本，除模擬樣本外，同時應包含若干臨床樣本，至少包含陰性樣品、臨界陽性樣品、（中或強）陽性樣品。精密度評價試驗及注冊檢驗過程中應包含核酸分離/純化步驟。重復性參考品中應包括高、低兩個濃度的樣本，其中低濃度應為最低檢出限附近的濃度。

3.1.5 企業(yè)參考品的設置與制備

2020年4月16日，中國食品藥品檢定研究院標準物質和標準化管理中心發(fā)布了《注冊檢驗用體外診斷試劑國家標準品和參考品目錄（第八期）》，目錄中增加了6個新型冠狀病毒抗體、抗原及核酸檢測試劑相關的國家參考品，此批應急用國家參考品可用于評估各申報試劑的性能，但沒有公布量值及計量溯源。

各企業(yè)應根據(jù)產(chǎn)品性能的實際情況，同時參照中國食品藥品檢定研究院的新型冠狀病毒核酸檢測試劑國家參考品設置企業(yè)內部參考品的項目及內容，包括陽性參考品、陰性參考品、檢測限參考品、重復性參考品，且應不低于國家參考品要求。其中，陽性參考品應至少選取不同來源、不同滴度水平的5個病毒樣本。陰性參考品則主要包含對交叉反應進行驗證的樣本。檢測限參考品的濃度水平可等于或略高于最低檢測限的水平。企業(yè)應對內部參考品的來源、型別鑒定、病毒滴度等信息進行精確的試驗驗證，并提交詳細的方法、使用試劑、具體數(shù)據(jù)結果等驗證資料。除SARS冠狀病毒、MERS冠狀病毒可采用假病毒外，參考品應均為臨床真實樣本。

3.1.6 不同樣本類型的核酸提取方法/試劑驗證

目前有多種樣本類型，拭子材質、采集方法、樣本采集量和采樣時機等都與病毒載量密切相關，可直接影響到試劑的檢出率。《診療方案第七版》中，明確病原學檢查樣本包括：鼻咽拭子、血液、痰和其他下呼吸道分泌物、糞便等標本[1]?！缎滦凸跔畈《靖腥镜姆窝讓嶒炇覚z測技術指南》中將標本采集種類做了進一步的細化，包括鼻咽拭子、鼻咽抽取物、呼吸道抽取物、深咳痰液、支氣管灌洗液、肺泡灌洗液、肺組織活檢標本、眼結膜拭子及便標本，并對不同類型的樣本分別有相應的采集及保存要求[6]。2020年7月21日，國務院應對新型冠狀病毒肺炎疫情聯(lián)防聯(lián)控機制醫(yī)療救治組發(fā)布了《新冠病毒核酸篩查稀釋混樣檢測》中，規(guī)定原則上不超過5個的咽拭子進行充分混合，形成混合待檢樣本。面對種類眾多的樣本類型，且包括混合樣品，這就需要企業(yè)對于上述所有樣本類型的核酸提取試劑/方法的提取效率、提取純度等，有針對性地對樣本的滅活/液化、加樣體積和模板洗脫體積做研究驗證，明確說明具體操作過程，并提供詳細的驗證資料。若提取過程中涉及配套使用的自動核酸提取儀，企業(yè)還需要提供核酸提取儀的相關注冊證書、儀器使用說明書及配套提取試劑盒的使用說明書。從而確保檢測體系具有可控性，提高試劑靈敏度，降低假陰性結果的出現(xiàn)，保證檢測過程順利進行。

3.2 抗體檢測試劑性能質量控制要點

抗體檢測質量控制要點與核酸檢測基本一致，但考慮抗體檢驗容易受到樣本溶血、纖維蛋白、細菌污染或患者自身抗體等因素的影響，容易造成假陽性。因此，內源/外源物質干擾驗證及血液樣本滅活方式對試劑的影響也需要企業(yè)進行合理驗證。據(jù)薛雄燕等[7]報道，采用熒光免疫分析法檢測SARS-Co V-Ig M，滅活前結果為陰性的標本，滅活處理后所有檢測結果均為陽性，陰性符合率為0，表明此方法不可采用56℃、30min滅活處理后的樣本進行檢測。說明不同的滅活方法會影響抗體檢測結果，企業(yè)應在試劑說明書中寫明樣本滅活方法，并加以驗證。對于同時可檢測Ig M、Ig G兩種抗體的檢測試劑盒，企業(yè)陽性參考品制備時要注意合理均勻分配兩種抗體陽性樣本的比例，且應包含有Ig M、Ig G兩種抗體陽性的樣本，也包含有Ig M、Ig G單獨抗體陽性的樣本。

4 建議

2019新型冠狀病毒肺炎疫情的突發(fā)是對企業(yè)的研發(fā)能力、生產(chǎn)能力的一場巨大考驗，也是對臨床實驗室的檢測能力、安全防范的一次極大挑戰(zhàn)。疫情在全球范圍內蔓延造成了對SARS-Co V-2檢測試劑的巨大需求，研發(fā)生產(chǎn)出更加快速、便捷、準確的SARS-Co V-2檢測試劑成為各個廠家研發(fā)的目標。疫情初期，對實驗室檢測結果出現(xiàn)假陽性、假陰性的質疑聲不絕于耳，但檢測過程中的各個環(huán)節(jié)都會影響檢測結果的準確度，如：試劑質量、采用方式、樣品質量、操作人員、儀器性能等。應急研發(fā)生產(chǎn)的試劑在質量方面可能存在差異，仍有待進一步進行驗證及比對。但各個檢測實驗室應根據(jù)自身具體情況，制定建立完整、合理和科學的技術操作規(guī)程、生物安全防護管理制度、結果質量保證措施及結果報告的規(guī)范等，同時應對檢測人員進行嚴格的培訓與考核。各個檢測實驗室應針對不同儀器、人員、方法和試劑開展室間質評實驗比對活動，確保最終結果的準確性和可靠性，以便更好地指導臨床診療工作。在注冊檢驗及審批過程中應加強質量把控，保證檢驗質量，提高檢驗效率，確保檢驗結果的準確可靠，從而確保上市產(chǎn)品的質量。隨著技術的發(fā)展與研究的深入，病毒檢測技術與方法日趨成熟完善，SARS-Co V-2檢測試劑會更好地服務于臨床，為做好常態(tài)化疫情防控工作提供強有力技術支撐。

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