克霉唑為咪唑類廣譜抗真芮藥，是治療真蔭感染疾病的合成抗菌藥，對多種真菌尤其是白色念珠菌具有較好的抗菌作用?？嗣惯?qū)儆诘诙溥蝾惖目拐婢帲?981年和咪康嘩、酮康嘩、益康嘩等抗真菌藥在美國上市。美國食品和藥品監(jiān)督管理局(FDA)目前只批準了嘩類、嘧啶類和多烯類等抗真菌藥用于人體的全身性真菌治療。目前已發(fā)現(xiàn)大多數(shù)抗真菌藥具有細胞毒性較強的問題。因此有必要加強對動物源食品中克霉唑殘留量的檢測。

目前國內(nèi)外對克霉唑的測定主要集中在藥品方面，采用的方法多為高效液相色譜法。關于環(huán)境和食品克霉唑測定研究較少，Assress等采用了UHPLC-QTOF-MS對污水中克霉唑在內(nèi)的嘩類殺菌劑進行目標定量及其他新興污染物的篩選，張凱等采用UPLC-MS/MS法測定了羊肉中克霉嘩在內(nèi)的8種抗真菌藥含黃。加速溶劑提取(ASE)具有提取效率高、所用溶劑少、重現(xiàn)性好等優(yōu)點，氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)將色譜高效的分離效能和質(zhì)潛的高靈敏度、強抗十擾的臨測能力相結(jié)合，實現(xiàn)了在復雜基質(zhì)背景下對目標物的準確測定。有關動物源食品中克霉唑殘留的GC-MS/MS測定國內(nèi)外尚未見報道。本文以環(huán)己烷/乙酸乙酯為提取溶劑，加速溶劑提取動物源食品中殘留的克霉唑，提取液經(jīng)凝膠滲透色譜凈化后進行GC-MS/MS分析，同位素內(nèi)標法定量，該方法能夠滿足動物源食品中克霉唑殘留最的確證和定苗分析。

1材料與方法

1.1材料與儀器

豬肉、雞肉、豬脂肪、豬心、豬肝、豬腎樣品市售；克霉嘩標準品(CASN0.23593-75-1，99.9％純度)德國Dr.EhrenstorferCml)H；克霉唑-d5(99.0％純度)加拿大CDN公司；色譜純乙腈、正己烷和乙酸乙酯德國Merck公司。
Milli-QAdvantageA10超純水系統(tǒng)：美國Millipore公司；STl6R離心機：美國Thermo公司；GM300組織搗碎機：德國萊馳公司；MS105DU電子天平、PL203電子天平：梅特勒公司；T18型均質(zhì)器德國IKA公司；DionexASE350加速溶劑提取儀：美國Dionex公司；GPCVario凝膠滲透色潛儀：德國LC-Tech公司；ThermoFisherTrace1300-TSQ8000三重四極桿氣相色潛-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Therrno公司。

1.2實驗方法

1.2.1標準溶液配制

取克霉唑標準品10mg，用乙腈溶解并轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，用乙腈定容，制得100μg/mL克霉唑標準儲備液；取克霉嘩-d₅標準品1mg，用乙腈溶解并轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶中，用乙腈定容，制得100μg/mL克霉嘩-d₅標準儲備液。用乙腈稀釋配制濃度分別為1、2、5、20、50、100μg/L的系列標準工作溶液，其巾克霉嘩-d₅同位素內(nèi)標溶液濃度均為20μg/L。

1.2.2試樣制備

取有代表性豬肉、雞肉、豬脂肪、豬心、豬肝、豬腎樣品樣品各500g，將其切碎后，用組織搗碎機將樣品加工成漿狀，混勻，裝入潔凈的盛樣容器內(nèi)，密封并標明標記。

1.2.3加速溶劑(ASE)提取

稱取3.0g制備好的樣品并轉(zhuǎn)移至陶瓷研缽中，加入60μL、濃度為1.0μg/mL的克霉唑-d₅標準溶液，再加入60目硅藻土5g并充分研磨，轉(zhuǎn)移研磨好的樣品于10mL的提取池中，進行加速溶劑(ASE)提取，提取條件為：提取溶劑為環(huán)己烷和乙酸乙酯，體積比為1:1，提取溫度100℃，加熱并靜態(tài)提取5min，對提取池體積30％的提取溶劑進行氮氣吹掃60s后得到提取液。將提取液轉(zhuǎn)移至50mL圓底燒瓶中，在35℃水浴中，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至小于3mL，轉(zhuǎn)移剩余液體至10mL刻度離心管中，補加體積比為1:1的環(huán)己烷和乙酸乙酯至3mL，制得待凈化液，備用。

1.2.4凝膠滲透色譜(GPC)凈化

凝膠滲透色譜(GPC)條件如下：凈化柱：500mm×10mm，填裝10gBioBeads-X3填料，柱床高32cm；流動相：體積比為1:1的環(huán)己烷和乙酸乙酯，流速為1.0mL/min；樣品定量環(huán)為1mL；預淋洗體積為17mL；洗脫體積為15mL；清洗體積為5mL。稱取3.0g制備好的樣品并轉(zhuǎn)移至陶瓷研缽中，加入60μL、濃度為1.0μg/mL的克霉唑-d₅標準溶液，再加入60目硅藻土5g并充分研磨，轉(zhuǎn)移研磨好的樣品于10mL的提取池中，進行加速溶劑(ASE)提取，提取條件為：提取溶劑為環(huán)己烷和乙酸乙酯，體積比為1:1，提取溫度100℃，加熱并靜態(tài)提取5min，對提取池體積30％的提取溶劑進行氮氣吹掃60s后得到提取液。將提取液轉(zhuǎn)移至50mL圓底燒瓶中，在35℃水浴中，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至小于3mL，轉(zhuǎn)移剩余液體至10mL刻度離心管中，補加體積比為1:1的環(huán)己烷和乙酸乙酯至3mL，制得待凈化液，備用。制備的待凈化液1mL通過凝膠滲透儀按上述條件凈化，收集洗脫液于刻度離心管中。

1.2.5液液分配

將收集到的洗脫液于45℃的水浴中氮氣吹至近干，取0.5mL乙腈飽和的正己烷渦旋振蕩溶解殘余物，再加入0.5mL正己烷飽和的乙腈，渦旋振蕩并靜置分層，吸出乙腈層于2mL進樣小瓶中，向刻度離心管中重復加入0.5mL正己烷飽和的乙腈重復操作一次，合并乙腈層，過0.22μm濾膜于GC-MS/MS的進樣小瓶中，制得待測樣品溶液，供GC-MS/MS測定。

1.2.6基質(zhì)匹配標準溶液的配制

取有代表性豬肉、雞肉、豬脂肪、豬心、豬肝、豬腎樣品樣品各500g，將其切碎后，用組織搗碎機將樣品加工成漿狀，混勻，裝入潔凈的盛樣容器內(nèi)，密封并標明標記。稱取3.0g制備好的樣品并轉(zhuǎn)移至陶瓷研缽中，加入60μL、濃度為1.0μg/mL的克霉唑-d₅標準溶液，再加入60目硅藻土5g并充分研磨，轉(zhuǎn)移研磨好的樣品于10mL的提取池中，進行加速溶劑(ASE)提取，提取條件為：提取溶劑為環(huán)己烷和乙酸乙酯，體積比為1:1，提取溫度100℃，加熱并靜態(tài)提取5min，對提取池體積30％的提取溶劑進行氮氣吹掃60s后得到提取液。將提取液轉(zhuǎn)移至50mL圓底燒瓶中，在35℃水浴中，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至小于3mL，轉(zhuǎn)移剩余液體至10mL刻度離心管中，補加體積比為1:1的環(huán)己烷和乙酸乙酯至3mL，制得待凈化液，備用。凝膠滲透色譜(GPC)條件如下：凈化柱：500mm×10mm，填裝10gBioBeads-X3填料，柱床高32cm；流動相：體積比為1:1的環(huán)己烷和乙酸乙酯，流速為1.0mL/min；樣品定量環(huán)為1mL；預淋洗體積為17mL；洗脫體積為15mL；清洗體積為5mL。稱取3.0g制備好的樣品并轉(zhuǎn)移至陶瓷研缽中，加入60μL、濃度為1.0μg/mL的克霉唑-d₅標準溶液，再加入60目硅藻土5g并充分研磨，轉(zhuǎn)移研磨好的樣品于10mL的提取池中，進行加速溶劑(ASE)提取，提取條件為：提取溶劑為環(huán)己烷和乙酸乙酯，體積比為1:1，提取溫度100℃，加熱并靜態(tài)提取5min，對提取池體積30％的提取溶劑進行氮氣吹掃60s后得到提取液。將提取液轉(zhuǎn)移至50mL圓底燒瓶中，在35℃水浴中，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至小于3mL，轉(zhuǎn)移剩余液體至10mL刻度離心管中，補加體積比為1:1的環(huán)己烷和乙酸乙酯至3mL，制得待凈化液，備用。制備的待凈化液1mL通過凝膠滲透儀按上述條件凈化，收集洗脫液于刻度離心管中。將收集到的洗脫液于45℃的水浴中氮氣吹至近干，取0.5mL乙腈飽和的正己烷渦旋振蕩溶解殘余物，再加入0.5mL正己烷飽和的乙腈，渦旋振蕩并靜置分層，吸出乙腈層于2mL進樣小瓶中，向刻度離心管中重復加入0.5mL正己烷飽和的乙腈重復操作一次，合并乙腈層，過0.22μm濾膜于GC-MS/MS的進樣小瓶中，制得待測樣品溶液，供GC-MS/MS測定。制備不含待測組分的空白基質(zhì)溶液五份各1mL，氮氣吹干，再各取克霉唑標準品10mg，用乙腈溶解并轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，用乙腈定容，制得100μg/mL克霉唑標準儲備液；取克霉嘩-d5標準品1mg，用乙腈溶解并轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶中，用乙腈定容，制得100μg/mL克霉嘩-d₅標準儲備液。用乙腈稀釋配制濃度分別為1、2、5、20、50、100μg/L的系列標準工作溶液，其巾克霉嘩-d₅同位素內(nèi)標溶液濃度均為20μg/L。配制好的1、2、5、20、50、100μg/L的系列標準工作溶液1mL復溶，配得1、2、5、20、50、100μg/L的系列基質(zhì)匹配標準工作溶液，其中克霉唑-d₅同位素內(nèi)標的濃度均為20μg/L。

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