1.2懸浮培養(yǎng)

在愈傷組織培養(yǎng)基礎(chǔ)上開展懸浮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)研究,是實(shí)現(xiàn)細(xì)胞規(guī)模化生產(chǎn)、進(jìn)而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)業(yè)化的必經(jīng)之路。以提高生物量、提高活性物質(zhì)含量為目的，研究人員對(duì)天山雪蓮細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，比較了反應(yīng)器類型、培養(yǎng)體系、生物合成前體、誘導(dǎo)子類型以及光譜特性等因素對(duì)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)結(jié)果的影響。

1.2.1反應(yīng)器類型

應(yīng)用間歇浸沒式小反應(yīng)器培養(yǎng)天山雪蓮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)初期0~6d細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，到15d時(shí)生物量和黃酮的產(chǎn)量達(dá)到最大值，分別為12.13g/L和620.08mg/L，生物量只有搖瓶培養(yǎng)的2/3；應(yīng)用氣升式反應(yīng)器培養(yǎng)天山雪蓮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)初期0~3d細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，3d后細(xì)胞開始快速生長(zhǎng)，到第15天時(shí)達(dá)到最大值11.7g/L，培養(yǎng)過程中黃酮含量除在第3天有一個(gè)輕微的上升外，一直呈下降趨勢(shì)。2種反應(yīng)器培養(yǎng)雪蓮細(xì)胞過程中pH和電導(dǎo)率與搖瓶培養(yǎng)相比變化緩慢。

1.2.2培養(yǎng)體系

通過比較不同的基礎(chǔ)培養(yǎng)基對(duì)雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)MS培養(yǎng)基最有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)，懷特培養(yǎng)基中的細(xì)胞黃酮含量最高，而在B5培養(yǎng)基中獲得最高黃酮產(chǎn)量。通過考察不同培養(yǎng)基、培養(yǎng)基初始pH、碳源、接種量、植物生長(zhǎng)物質(zhì)含量對(duì)雪蓮細(xì)胞生長(zhǎng)和黃酮合成的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，N6液體培養(yǎng)基在pH5.8、蔗糖50g/L、接種量60~80g/L時(shí)有利于細(xì)胞生長(zhǎng)和黃酮合成，附加BA0.2mg/L+NAA2mg/L有利于黃酮合成,而附加BA0.5mg/L+NAA3mg/L則對(duì)生長(zhǎng)有利。應(yīng)用培養(yǎng)基MS+NAA5.0mg/L+蔗糖3%，在pH5.8、振蕩器轉(zhuǎn)速（120±5）r/min、培養(yǎng)溫度（24±1）℃、光照周期12h/d以及光照強(qiáng)度85μmol·m-2/s培養(yǎng)條件下，采用最佳接種質(zhì)量濃度2.53g/L，在懸浮培養(yǎng)14d時(shí)細(xì)胞的干重和鮮重均達(dá)到最大，分別為16.85、235.28g/L。

1.2.3有機(jī)添加物

添加苯丙氨酸和水解酪蛋白能夠顯著地提高黃酮的合成量，分別比未添加對(duì)照提高了47.68%和21.59%；添加椰乳顯著地提高細(xì)胞生長(zhǎng)，生物量比對(duì)照提高了36.1%。

1.2.4外源添加碳源和生物合成前體

在每升培養(yǎng)基添加蔗糖50g和生物合成前體L-苯丙氨酸500mg的優(yōu)選培養(yǎng)條件下，僅需培養(yǎng)16d，紫丁香苷、綠原酸和1,5-二咖啡?？崴岬馁|(zhì)量濃度即可以分別達(dá)到339.0、225.3、512.7mg/L；三者的含量分別為野生藥材的67.9、1.9、10.6倍。

1.2.5添加誘導(dǎo)子

1.2.5.1非生物誘導(dǎo)子

在培養(yǎng)的第14天添加濃度為50μmol/L的一氧化氮，總黃酮量和產(chǎn)量的最大值分別為46.15mg/g和830.7mg/L；在第14天添加濃度為50μmol/L的水楊酸，總黃酮量和產(chǎn)量的最大值分別為46.81mg/g和701.79mg/L；在第6天添加濃度為100μmol/L的茉莉酸甲酯，總黃酮量和產(chǎn)量的最大值分別為52.33mg/g和924.67mg/L。3種非生物誘導(dǎo)子均能促進(jìn)總黃酮含量和苯丙氨酸代謝途徑關(guān)鍵酶PAL活性的增加，除水楊酸外，也能促進(jìn)細(xì)胞生物量的增加。25mg/L的殼聚糖誘導(dǎo)子對(duì)生物量沒有明顯的促進(jìn)作用，但能顯著地促進(jìn)黃酮的合成，最大的黃酮產(chǎn)量高達(dá)1243.5mg/L，比對(duì)照提高了33%。

1.2.5.2生物誘導(dǎo)子

5種真菌誘導(dǎo)子F1817、F1832、F1780、F1953、F2563均能促進(jìn)次生代謝產(chǎn)物總黃酮和紫丁香苷的積累，誘導(dǎo)效果最好的為誘導(dǎo)子F1953，總黃酮和紫丁香苷含量均達(dá)到最大值，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為46.56mg/g和3.03mg/g。

1.2.5.32類誘導(dǎo)子聯(lián)合使用

通過非生物誘導(dǎo)子（一氧化氮、水楊酸和茉莉酸甲酯）和生物誘導(dǎo)子（F1817、F1832、F1780、F1953和F2563）的聯(lián)合誘導(dǎo)提高了天山雪蓮細(xì)胞有效成分的含量，細(xì)胞中總黃酮量最大值為60.41mg/g，是野生藥材的3.00倍；培養(yǎng)物中紫丁香苷量達(dá)到3.10mg/g，是野生藥材的11.48倍。

1.2.6光譜特性

紅光最有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)，在紅光下獲得最大生物量；藍(lán)光最有利于黃酮的合成，在藍(lán)光下獲得最大黃酮含量和產(chǎn)量。藍(lán)光加白光的組合有利于黃酮的合成。

1.3毛狀根培養(yǎng)

天山雪蓮這一品種的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)研究主要集中于愈傷組織培養(yǎng)和懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，毛狀根培養(yǎng)的報(bào)道較少。付春祥等利用發(fā)根農(nóng)桿菌R1601、R1000、LBA9402感染新疆雪蓮的葉片、葉柄和根段外植體，誘導(dǎo)產(chǎn)生毛狀根。毛狀根接種量為2.8g/L時(shí)，20d生長(zhǎng)量可達(dá)66.7g/L，黃酮含量達(dá)到干重的10.23%。冠癭堿的檢測(cè)和rolB基因的PCR分析表明，Ri質(zhì)粒中的T-DNA片段已經(jīng)整合到毛狀根細(xì)胞的基因組中。預(yù)培養(yǎng)2d的新疆雪蓮根段外植體，經(jīng)過R1601感染后，毛狀根的誘導(dǎo)率可達(dá)100%，說明預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、外植體類型以及發(fā)根農(nóng)桿菌的菌株屬性對(duì)毛狀根誘導(dǎo)有著重要的影響。喬獻(xiàn)麗等研究了外源激素GA3和IAA對(duì)3個(gè)轉(zhuǎn)基因新疆雪蓮類黃酮高產(chǎn)毛狀根系C17、C27、C46總黃酮含量的影響，結(jié)果表明，與未用激素處理的毛狀根相比，外源激素GA3和IAA能顯著提高毛狀根培養(yǎng)物中芹菜素和總黃酮的含量。毛狀根系的組織干重與類黃酮的含量沒有相關(guān)性。

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