乳酸乳球菌胞外多糖（EPS）為乳酸菌在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中分泌到細(xì)胞壁外的一類多糖類化合物。由于乳酸菌相比其他工業(yè)用菌安全性高，故近年來(lái)對(duì)乳酸菌胞外多糖的研究也逐漸增多。從已有的研究結(jié)果來(lái)看，合成EPS的乳酸菌中乳酸乳球菌合成能力較強(qiáng)，為80～600mg/L。胞外多糖作為食品添加劑，可用作多種食品的增稠劑、穩(wěn)定劑、乳化劑和凝膠劑；具有生物活性如免疫活性、抗腫瘤和抗?jié)?，可?yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域，分子量大約為4.0×10⁴～6.0×10⁶之間。盡管長(zhǎng)期以來(lái)研究者們對(duì)乳酸菌產(chǎn)EPS的化學(xué)組成存在著分歧，但是較一致認(rèn)為：從乳酸菌中分離得到的胞外聚合物是由α-和β-連接糖重復(fù)單元所組成的多糖，并且不同乳酸菌分泌的EPS類型不同。雖然單糖組成可能有些相似，多為半乳糖、葡萄糖和鼠李糖，但是各成分比率不同。由于發(fā)酵液中EPS的產(chǎn)量較低、蛋白質(zhì)含量較高，給EPS的提取帶來(lái)較大困難。因此，發(fā)酵液中提取EPS工藝關(guān)鍵即是蛋白質(zhì)的除去與EPS的沉淀，可得到穩(wěn)定、易使用、雜質(zhì)少的多糖產(chǎn)品。本實(shí)驗(yàn)對(duì)乳酸乳球菌發(fā)酵液通過(guò)不同的條件進(jìn)行提取純化EPS，驗(yàn)證最佳除蛋白條件和多糖沉淀?xiàng)l件，為工業(yè)化生產(chǎn)乳酸菌胞外多糖奠定理論基礎(chǔ)。

一、材料與方法

1、材料與試劑

乳酸乳球菌乳亞種LL9（以下簡(jiǎn)稱乳球菌LL9）：鄭州輕工業(yè)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供，由乳酸乳球菌乳亞種6242（中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC））紫外誘變，經(jīng)葡萄糖耐受及乳鏈菌肽耐受水平篩選挑出，比較生物活性最終篩出活性高、乳鏈菌肽產(chǎn)量高的最優(yōu)化菌株。

分離純化條件為：發(fā)酵液→添加三氯乙酸至2.5%（w/v）→500r/min攪拌5min→4℃沉淀除蛋白20min→10000r/s離心20min除菌體→上清液透析12h→苯酚硫酸法測(cè)定EPS?？傻?u>乳酸菌胞外多糖的產(chǎn)量為262.63mg/L。

6%的苯酚溶液：精確稱取6.0g重蒸酚晶體，用少量的蒸餾水溶解后倒入100mL的容量瓶中，定容、充分搖勻，倒入棕色試劑瓶中備用。

2、實(shí)驗(yàn)方法

（1）菌種活化

保存于甘油管中乳球菌LL9接種于MRS液體培養(yǎng)基內(nèi)，37℃培養(yǎng)，傳代2～3次后，染色鏡檢，挑選優(yōu)良菌株，轉(zhuǎn)接斜面培養(yǎng)，4℃冰箱冷藏保藏備用。

（2）搖瓶發(fā)酵

活化后菌液5%轉(zhuǎn)入搖瓶發(fā)酵，37℃恒溫150r/min震蕩培養(yǎng)24h。

（3）發(fā)酵液處理

取發(fā)酵終點(diǎn)發(fā)酵液，10000×g下離心8min去除菌體，取上清液備用。

（4）苯酚硫酸法測(cè)定

EPS該方法較適合乳酸菌EPS檢測(cè)，相對(duì)誤差為0.2%，具有較好的準(zhǔn)確性。透析液經(jīng)稀釋取2.0mL加入1.0mL6.0%的苯酚溶液，5.0mL95.0%的濃硫酸，靜置10min，高速振蕩器上振蕩搖勻，靜置20min至冷卻。490nm測(cè)定OD值。標(biāo)準(zhǔn)曲線上查找對(duì)應(yīng)糖含量，即得乳酸菌胞外多糖產(chǎn)量。

（5）提取純化工藝流程

斜面→MRS液體培養(yǎng)基活化兩次（37℃，24h）→搖床擴(kuò)大培養(yǎng)（37℃，150r/min，24h）→離心去除菌體（5mL，10000×g，8min）→添加三氯乙酸50%（w/v）（12h）→500r/min攪拌5min→離心沉淀除蛋白（4℃，18000×g，30min）→上清加乙醇沉淀多糖（100%，3倍體積，4℃，處理12h）→離心（12000×g，30min）→冷凍干燥→沉淀溫水溶解（稀釋10倍）→透析MD34（4℃，處理12h）→苯酚-濃硫酸法測(cè)定OD值→EPS純度鑒定

二、結(jié)果與分析

1、苯酚硫酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

用葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)物，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由圖1可知，糖濃度在0～32mg/L時(shí)，糖濃度和透光度呈線性關(guān)系。

2、除蛋白條件優(yōu)化

（1）除蛋白中三氯乙酸濃度的優(yōu)化

將發(fā)酵液通過(guò)離心的方法除去菌體后，分別加入30%、40%、50%的三氯乙酸溶液1/5體積，探討不同三氯乙酸濃度對(duì)蛋白質(zhì)沉淀的影響，如圖2所示。三氯乙酸濃度在30%～50%時(shí)與發(fā)酵液多糖產(chǎn)量呈正比關(guān)系，三氯乙酸濃度過(guò)高會(huì)對(duì)多糖的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，因此初步確定除蛋白階段三氯乙酸的最優(yōu)濃度為50%。

（2）除蛋白中離心力優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)中發(fā)酵液細(xì)胞分離后，加入50%的三氯乙酸溶液1/5體積，分別在10000×g、12000×g、13000×g、16000×g離心力下離心30min，選取最優(yōu)化離心條件，如圖3所示。在離心力16000×g時(shí)，多糖得率達(dá)到最大值，選16000×g為最優(yōu)離心力。

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