中國是世界上最大的抗生素生產(chǎn)和使用國．據(jù)估計(jì)，我國抗生素年使用量超過1.6×105t，然而藥用抗生素只有少部分可以被機(jī)體吸收利用，大部分會以藥物原形或代謝產(chǎn)物的形式進(jìn)入環(huán)境．抗生素一旦進(jìn)入環(huán)境，可能通過食物鏈進(jìn)行傳遞，進(jìn)而對人類和動物健康以及生態(tài)環(huán)境造成極大的威脅．另一方面，在低濃度長期暴露下，抗生素還會誘導(dǎo)產(chǎn)生抗性基因．因此，了解抗生素在環(huán)境中的賦存水平，可以為相關(guān)環(huán)境部門評估抗生素生態(tài)風(fēng)險與管理抗生素的使用提供強(qiáng)有力的數(shù)據(jù)支撐．

氟喹諾酮類抗生素(FQs)是在喹諾酮類抗生素主環(huán)的6位或8位加上1個F原子衍生而來，因其具有廣譜性、抗菌性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致其在環(huán)境中有較高的檢出率和檢出濃度．目前，環(huán)境樣品中FQs的定量方法主要有高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、酶聯(lián)免疫分析法等．但是在復(fù)雜的基質(zhì)干擾下，對目標(biāo)污染物的準(zhǔn)確檢測要求儀器有較高的選擇性和靈敏度，電噴霧離子源高分辨飛行時間質(zhì)譜可提供目標(biāo)物母離子和碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)，不僅提高了目標(biāo)物定性篩查的可靠性，也可獲得較高靈敏度的定量數(shù)據(jù)．

本文利用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜(UPLC-QTOF)在電噴霧正離子條件的3種模式:MS (Mass Scan)、MSE、MRM (Multiple Reaction Monitoring)，建立同時測定5種FQs的定量分析方法，并與超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-TQMS)的方法進(jìn)行比較研究．

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

超高效液相色譜-四極桿串聯(lián)時間飛行質(zhì)譜儀(UPLC-QTOF，美國Waters)，配有電噴霧離子源；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(UPLC-TQMS，美國Waters)，配有電噴霧離子源；PURELAB flex純水儀(英國ELGA)；玻璃纖維濾膜(GF/F,0.7μm，英國Whatman)；Oasis親水親油平衡(Hydrophilic Lipophilic Balance,HLB)固相萃取柱(500 mg,6 m L，美國Waters)；甲醇、乙腈(HPLC級，德國Merck)；HPLC級甲酸(HPLC級，阿拉丁)；本實(shí)驗(yàn)用水均為超純水(18.2 MΩ·cm).

標(biāo)準(zhǔn)品:環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin,CFX)、恩諾沙星(Enrofloxacin,EFX)、諾氟沙星(Norfloxacin,NFX)、氧氟沙星(Ofloxacin,OFX)、培氟沙星(Pefloxacin,PFX)和內(nèi)標(biāo)環(huán)丙沙星-D₈(CiprofloxacinD₈,CFX-D₈)均購于德國Dr.Ehrenstorfer Gmb H．所有標(biāo)準(zhǔn)品純度均不低于98%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))．

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:準(zhǔn)確稱取適量各標(biāo)準(zhǔn)品，并用甲醇溶解配制成質(zhì)量濃度為100 mg/L的單一標(biāo)準(zhǔn)儲備液，放入-20℃低溫的冰箱中避光保存．

1.2質(zhì)譜方法的建立

1.2.1 UPLC-QTOF方法

將質(zhì)量濃度為100μg/L的各化合物單標(biāo)分別在UPLC-QTOF上進(jìn)行一級質(zhì)譜全掃描，分析得到母離子，并在高能量通道掃描其二級質(zhì)譜．隨后，在MRM模式下優(yōu)化5種FQs的特征離子對、毛細(xì)管電壓、碰撞能等質(zhì)譜參數(shù)，選取響應(yīng)強(qiáng)、干擾小的離子作為定量和定性離子．

1.2.2 UPLC-TQMS方法

將各FQs的單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品在全掃描模式下直接進(jìn)樣，并利用Mass Lynx4.1軟件中質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化的功能，確定各目標(biāo)化合物的最優(yōu)碰撞能、錐孔電壓等參數(shù)．

1.3色譜方法的建立

色譜柱選用Waters ACUITY UPLC BEH C18柱(50 mm×2.1 mm,1.7μm)．在低p H條件下可保持FQs在流動相中穩(wěn)定的溶解狀態(tài)，采用甲酸來控制流動相的p H，比較甲醇和乙腈作有機(jī)相時，目標(biāo)物色譜峰的峰形、響應(yīng)強(qiáng)度以及分離度．此外，本文考察了0.1%(體積分?jǐn)?shù)，全文同)甲酸水-甲醇、0.2%甲酸水溶液-甲醇、0.1%甲酸水溶液-甲醇作為流動相時對目標(biāo)物峰形和響應(yīng)值的影響．隨后，調(diào)節(jié)流動相初始體積比和洗脫梯度，確定最佳液相測試方法．

柱溫不僅會影響目標(biāo)化合物的保留時間，也會影響目標(biāo)物的分離和響應(yīng)．比較不同柱溫(30、40、50℃)對目標(biāo)化合物響應(yīng)強(qiáng)度的影響．

在UPLC-TQMS上直接應(yīng)用UPLC-QTOF確定的色譜柱、流動相及液相洗脫方法，并適當(dāng)優(yōu)化洗脫梯度，以使目標(biāo)化合物的響應(yīng)和峰形更好．

1.4方法性能的比較

1.4.1線性關(guān)系

將標(biāo)準(zhǔn)儲備液逐級稀釋，配制成質(zhì)量濃度為0.5、1、5、10、20、50、100μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照優(yōu)化后的色譜-質(zhì)譜條件測定，使用內(nèi)標(biāo)法定量．以目標(biāo)物定量離子與內(nèi)標(biāo)定量離子的峰面積之比為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線．

1.4.2定量限、檢出限及數(shù)據(jù)存儲大小比較

為測定儀器檢出限和定量限，將低濃度的混標(biāo)工作液(7個平行樣)在2臺儀器的各個模式下分別連續(xù)測定，同時準(zhǔn)備7組甲醇溶液，按以上步驟測定．通過幾次測定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差，計(jì)算儀器檢出限和定量限．此外，比較UPLC-QTOF的3種質(zhì)譜采集模式下和UPLC-TQMS的MRM模式下，測定1個樣品所需的數(shù)據(jù)存儲空間．

1.4.3儀器的精密度

對低、中、高質(zhì)量濃度的FQs混標(biāo)工作液重復(fù)測定6次，根據(jù)6次重復(fù)測定數(shù)據(jù)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差來考察儀器的精密度．

1.5方法應(yīng)用

于廣東省茅洲河上游和中游分別采集3個1 L水樣，加入0.4 m L 4 mol/L硫酸以調(diào)節(jié)p H，加入50m L甲醇抑制微生物的生長．上游和中游樣品分別命名為樣品1、2．將水樣置于含有冰袋的采樣箱，迅速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室．參照文獻(xiàn)的方法，將1 L水樣過玻璃纖維濾膜，加入100μL 1 mg/L CFX-D₈內(nèi)標(biāo)，混勻后采用固相萃取法提取水樣中抗生素．依次用10 m L甲醇和10 m L超純水活化HLB萃取柱，將過濾后的水樣以5～10 m L/min的流速加載于固相萃取柱，樣品瓶用50 m L 5%甲醇水潤洗2次．用10 m L超純水清洗小柱，對萃取柱真空抽干2 h，用10 m L甲醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，用氮?dú)獯蹈?，?m L初始流動相復(fù)溶，采用孔徑為0.22μm的濾膜過濾，將濾液分別在2臺儀器各模式下進(jìn)行檢測．

2結(jié)果與討論

2.1質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.1.1 UPLC-QTOF質(zhì)譜條件

優(yōu)化的質(zhì)譜條件:電噴霧離子源，正離子模式；毛細(xì)管電壓為2.0 k V，錐孔電壓為40 V，離子源溫度為120℃；脫溶劑氣溫度為500℃，脫溶劑氣流速為800 L/h，錐孔氣流速為50 L/h；掃描模式MS/MSE/MRM，質(zhì)荷比m/z范圍為50～1 200；Lockmass為亮氨酸腦啡肽(2μg/L)溶液；采集時間0.5 s，采集間隔時間10 s，掃描精確質(zhì)荷比為556.277.5種FQs在該儀器上的質(zhì)譜采集參數(shù)見表1.UPLC-QTOF所采集目標(biāo)物的相對分子質(zhì)量偏差均小于±0.3 m Da，表明該儀器可提供較精確的質(zhì)荷比，可為復(fù)雜環(huán)境基質(zhì)樣品的準(zhǔn)確定量分析提供條件．

2.1.2 UPLC-TQMS的質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源、正離子模式；毛細(xì)管電壓為2.0 k V，錐孔電壓為40 V；離子源溫度為120℃，脫溶劑氣溫度為300℃；脫溶劑氣流速為800 L/h，錐孔氣流流速為150 L/h；掃描模式為MRM.FQs結(jié)構(gòu)中含有羧基和氨基，當(dāng)溶液為酸性時，其呈現(xiàn)陽離子狀態(tài)，并在ESI+模式下，易形成[M+H]+準(zhǔn)分子離子，可作為母離子．5種FQs及其內(nèi)標(biāo)在該儀器上的質(zhì)譜采集參數(shù)見表2.

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